过度训练对大鼠骨骼肌自由基代谢和MAPK信号通路p38蛋白表达的影响

李琳燕

(景德镇陶瓷学院体育系，江西景德镇333001)

过度训练对大鼠骨骼肌自由基代谢和MAPK信号通路p38蛋白表达的影响

李琳燕

(景德镇陶瓷学院体育系，江西景德镇333001)

目的:为探讨过度训练的机制，观察6周过度训练对大鼠骨骼肌自由基代谢MAPK信号通路p38的影响。方法:将30只Wistar大鼠随机分成两组，即安静对照组和过度训练组，过度训练组进行6周的递增负荷过度训练，通过整体机能状态和常规生化指标评定其运动疲劳的程度，并进一步测定其骨骼肌丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力及p38蛋白表达。结果:过度训练大鼠血清皮质醇、睾酮/皮质酮和血红蛋白显著下降(P＜0.01)，血尿素氮显著升高(P＜0.01)，且运动组大鼠睾酮、睾酮皮质酮比值、血红蛋白较正常组分别下降71.81%、85.21%和23.12%，皮质酮较正常组升高94.79%，分别超过30%、30%、20%和20%的人类过度训练诊断参考标准。同时，骨骼肌MDA含量明显升高(P＜0.01)，SOD活性和总抗氧化能力明显下降(P＜0.05)。肌糖原含量没有显著的变化，血糖出现了显著下降，p38的蛋白表达出现显著的升高(P＜0.01)。结论:过度训练引起的肌能量大量消耗，自由基生成加强，抗氧化能力减弱，过剩的自由基通过p38激活了MAPK系统，但这种激活并没有增加肌糖原的含量，推测MAPK对骨骼肌代谢的调节作用可能被低血糖水平所抑制。

过度训练;丙二醛;超氧化物歧化酶;总抗氧化能力;p38蛋白表达

有关运动与自由基的文献报道最早见于20世纪70年代末和80年代初［1－2］。目前普遍认为自由基的产生与剧烈运动即刻或运动后的许多细胞、组织、器官水平代谢的紊乱有直接关系［3－4］。过度训练中，引起机体运动源性自由基的生成增加［5－6］。此时，如果体内的抗氧化能力不能同比例增加，将会产生大量的过剩自由基，它们不仅会损伤生物膜的功能，也可对细胞内的信号转导通路产生影响，由此而影响组织能量代谢。

目前研究表明，p38是可以被运动和肌肉收缩所激活的三条MAPK通路之一。运动可使骨骼肌中的p38的蛋白表达和磷酸化水平升高，并推测p38可能参与运动激活细胞肌肉中GLUT－4的蛋白表达和易位，参与应激状态下骨骼肌细胞葡萄糖摄取和肌糖原的储备。而长期的过度训练对骨骼肌p38的影响及其与自由基代谢和糖原储备的关系，还未见报道。以此为切入点探讨大鼠过度训练对骨骼肌自由基代谢和MAPK信号转导通路的关系，旨在为揭示过度训练的分子生物学机制提供科学的依据，也可为探索延缓和消除运动性疲劳的方法和手段提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性Wistar大鼠30只，体重200g左右，由沈阳市双义实验动物研究所提供，合格证号:SCXK(辽)2004－0012，常规分笼饲养。根据随机设计原则，将实验大鼠按体重随机分为两组，即安静对照组(10只)、过度训练组(20只)。

1.2 过度训练方案

各组参照朱全等的过度训练模型［7］，1～3周通过递增游泳时间来递增运动负荷。第一周:5～30min，第二周30～60min，第三周60～120min;4～6周固定运动时间增加负重，第四周负重1%～2%体重，第五周2%～4%体重，第六周4%～6%体重。水池100×60×70cm，水温(30±2)℃，水深50cm，每只大鼠游泳面积＞300cm2，每周训练6天，休息1天。

1.3 样品的处理和指标测定

最后一次训练结束后，随机剔除多余大鼠，使每组大鼠均为8只。于实验前18h禁食不禁水。以10%的乌拉坦溶液按0.8g/kg体重给予麻醉。腹腔静脉采血。取右侧小腿腓肠肌，准确称取一定重量的肌肉(300mg)加4mL 5%三氯乙酸溶液，制成匀浆，3 000r/pm离心5min。吸取上清液，用分光光度法测定肌糖原含量、总超氧化物歧化酶的活性和丙二醛含量、总抗氧化能力及蛋白含量，用Western Blot方法测定骨骼肌p38的蛋白表达。

1.4 数理统计法

所有实验数据用SPSS11.5软件包进行统计学处理，统计学方法为方差分析(LSD法和Tamhane’St2)，均采用均数±标准差(±s)表示，显著性水平分P＜0.05和P＜0.01。

2 实验结果

2.1 整体状况观察

6周递增负荷游泳后，与对照组相比，过度训练组大鼠形体消瘦，神情疲惫，被毛稀疏，脱毛现象严重，有的甚至是露出整块皮肤，毛色变得晦暗，懒动，饮食量减少，大便松软，有时便溏。

2.2 一般生化指标变化

6周递增负荷游泳后，血清皮质醇、睾酮/皮质酮和血红蛋白显著下降(P＜0.01)，血尿素氮显著升高(P＜0.01)，且运动组大鼠睾酮、睾酮皮质酮比值、血红蛋白较正常组分别下降71.81%、85.21%和23.12%，皮质酮较正常组升高94.79%，分别超过30%、30%、20%和20%的人类过度训练诊断参考标准。同时，运动组大鼠血尿素氮较正常组升高47.97%。结合整体状态的观察提示:运动组大鼠已经达到过度训练状态［3］，见表1、表2。

2.3 6周递增负荷游泳对大鼠骨骼肌自由基代谢的影响

与安静对照组相比，过度训练组大鼠骨骼肌MDA含量明显升高(P＜0.01)，SOD活性和总抗氧化能力明显下降(P＜0.05)。提示:过度训练引起骨骼肌过氧化加强，抗氧化能力减弱，见表3。

表1 6周递增负荷游泳后各组大鼠血睾酮、皮质酮、睾酮/皮质酮值

表2 6周递增负荷游泳后各组大鼠血尿素氮(BUN)、血红蛋白(Hb)值

表3 6周递增负荷游泳后各组大鼠骨骼肌自由基代谢的变化

2.4 6周递增负荷游泳对大鼠骨骼肌肌糖原和p38的影响

过度训练大鼠骨骼肌的肌糖原含量没有显著的变化，血糖出现了显著下降，p38的蛋白表达出现显著的升高(P＜0.01)，见表4。

表4 6周递增负荷游泳后各组大鼠骨骼肌肌糖原和p38的变化

3 讨论

许多实验证实机体在长时间大负荷运动时，组织的耗氧量增加，产生自由基的数量也增加，而机体内抗氧化剂和合成抗氧化酶的微量元素消耗增加，如不能及时补偿，将导致抗氧化能力的下降，清除自由基的能力减弱，造成对组织细胞和线粒体等细胞器的损伤进而影响其功能。

细胞的生物信号转导是指细胞受到胞外的各种刺激后，通过细胞内的信号分子的逐级传递，最终产生一系列细胞质和细胞核生理生化变化的过程，包括对细胞增殖、分化、凋亡基因转录的调节作用［8］。MAPK家族由5种亚类组成:ERK1/2、JNK/SAPK、p38、ERK3/4、ERK5。其中以p38研究最为深入。有研究表明:生长因子、自由基、细胞因子、缺氧、胞内钙离子的变化和机械应力等都可以刺激MAPK信号级联，过度训练是否也会引起自由基代谢加强进而影响MAPK信号转导通路还未见报道。

3.1 过度训练对大鼠骨骼肌自由基代谢的影响

自由基是指具有未配对电子的原子、离子或分子等类物质。机体在正常生理状态下可产生少量的氧自由基，这些自由基可通过相互碰撞而猝灭，或被体内的酶促防御系统如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及非酶促防御系统如VitE、VitC等清除，通常不会造成组织的损伤。但是当自由基生成过多，超过了机体的清除能力，就会对生物膜中的不饱和脂肪酸进行攻击，使膜发生脂质过氧化反应，影响膜的结构和功能。

目前普遍认为自由基的产生与剧烈运动即刻或运动后的许多细胞、组织、器官水平代谢的紊乱有直接关系［9－10］。Reid［11］等利用DCF(细胞内荧光探针技术)技术研究发现隔肌收缩可产生并能够将ROS释放到肌肉细胞以外。线粒体是运动时ROS产生的主要来源已被多项研究所证实。Davis［12］等用EPR技术研究发现衰竭性运动大鼠肌肉匀浆中自由基信号显著高于安静对照组。且自由基是由半醌法来确定的，因此可以推测检测的自由基来自线粒体。Alessio等的研究表明，用巴比妥酸法(TBARS)测得的脂质过氧化与大鼠跑台运动负荷有关［13］。研究结果显示，经6周递增运动负荷过度训练的大鼠骨骼肌MDA的含量显著高于对照组。

细胞内抗氧化系统包括两部分，即抗氧化酶和抗氧化剂。在抗氧化酶中超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内对清除氧自由基最重要的抗氧化酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，大量的研究也证实了这一点。急性运动后，骨骼肌［14］中SOD的活性增加;长期的运动训练也会使骨骼肌SOD的活性显著增加，但也有许多研究未检测到SOD的运动适应性升高。有报道大鼠跑台训练后，大鼠的大脑皮层和心肌的SOD活性显著低于对照组。在研究发现，过度训练大鼠骨骼肌中的SOD显著低于对照组，总抗氧化能力也同样低于对照组。造成运动训练对SOD的影响结果一致的原因可能与检测SOD活性的技术、方法不同，运动训练的类型以及负荷等不同有关。结合过度训练对MDA的影响，提示:过度训练后大鼠骨骼肌自由基生成增加，抗氧化能力下降。

3.2 过度训练脾虚对大鼠骨骼肌p38的影响

p38MAPK是由360个氨基酸组成的酪氨酸磷酸化蛋白激酶。它是1993年Brester等在研究高渗环境对酵母的影响时发现的，它是哺乳动物细胞中发现的第3种MAPK。引起p38激活的刺激很多，研究发现，应激刺激(H2O2、热休克、高渗环境、蛋白合成的抑制剂、缺血/再灌注)以及脂多糖(LPS)等均可激活p38通路，其主要参与应激条件下细胞炎症反应和细胞调亡过程。

有研究发现，70%VO2max强度运动30min后就会有p38MAPK磷酸化的升高并持续60min，运动激活p38MAPK分子的同时，也激活下游的信号分子MAPKAPK 2［15］。在长时间剧烈运动后，如马拉松跑后p38MAPKγ的磷酸化可以升高4倍，但p38MAPKα的磷酸化无变化［16］。运动对p38MAPK途径级联激活与葡萄糖转运呈正相关。还有实验发现用p38的拮抗剂SB-203580可以明显降低运动后骨骼肌对葡萄糖摄取。其中可能的机制是p38可能参与运动激活细胞肌肉中GLUT－4的蛋白表达和易位;参与应激状态下骨骼肌细胞葡萄糖摄取的调节;p38还能够提高运动后骨骼肌对胰岛素的敏感性。

研究结果显示，6周递增大负荷训练后大鼠骨骼肌中p38活性升高，但并没有发现骨骼肌的糖原含量和GLUT4蛋白表达的升高。提示p38的升高并没有增加骨骼肌GLUT4的含量和肌糖原的储备，推测在过度运动后的低血糖和胰岛素的情况下，p38并没有影响GLUT4的表达以及肌糖原的储备。

有研究表明离体大鼠的骨骼肌中和p38MAPK磷酸化的增加，主要是由于应力变化所致;而与收缩相关的代谢和离子分布的变化，如活性氧产生、较高的机械应力性应激对p38的磷酸化有影响［17］。研究显示，过度训练后大鼠骨骼肌中的MDA含量升高，SOD和总抗氧化能力下降，推测可能是运动引起p38增加的刺激因素。ROS可通过引起细胞脂质过氧化或调节细胞凋亡相关基因而诱导细胞凋亡。ROS可激活p38MAPK通路，参与靶细胞损伤过程，在急性炎症性疾病中起重要作用。这一结果提示过度训练引发自由基生成的增加可能是激活p38的主要原因，同时p38对糖代谢的调节作用被运动后的低血糖作用所抑制。

4 结论

过度训练引起的肌糖原大量消耗，自由基生成加强，抗氧化能力减弱，过剩的自由基通过p38激活了MAPK系统，但这种激活并没有增加肌糖原的含量，推测MAPK对骨骼肌代谢的调节作用可能被低血糖水平所抑制。

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责任编辑:乔艳春

Effect of Overtraining on Free Radical Metabolism and Activity of PKB in Rat Skeletal Muscle

LI Linyan
(P．E．Department，Jingdezhen Ceramic Institute，Jingdezhen 333001，Jiangxi，China)

Objective:to investigate the mechanism of overtraining and observe the influence to p38 MAPK on free radical Metabolism of skeletal muscle caused by overtraining for six weeks．Methods:thirty male SD rats were randomly divided into control group without training and overtraining group．The rats in the overtraining groups took incremental over training for 6 weeks;Fatigue was evaluated by overall functional status and conventional biochemical indicators．In the further determination，the MDA，SOD，total antioxidant capacity and the protein expression of p38 were determined．Results:serum cortisol，Testosterone/Corticosterone，Hb of the rats in overtraining group decreased significantly(P＜0.01)，BUN increased significantly(P＜0.01)．Serum cortisol，Testosterone/Corticosterone，Hb in overtraining group is decreased by 71.81%，85.21%and 23.12%respectively．Corticosterone in overtraining group is 94．79%higher than that in the control group．They overtook reference standard for diagnosis of human over-training for 30%，30%，20%，20%．Each MDA in skeletal muscle increased significantly(P＜0.01)，SOD and simultaneously total antioxidant capacity in skeletal muscle decreased significantly(P＜0.05)，simultaneously．Muscle glycogen content did not change significantly，glucose decreased significantly，and the protein expression of p38 increased significantly(P＜0.01)．Conclusion:large amount of energy consumption in skeletal muscle，the increasing of radical generation，the reduced antioxidant capacity，excess radical caused by overtraining activated MAPK，but didn’t increase the content of muscle glycogen．It is speculated that MAPK regulates skeletal muscle metabolic may be inhibited by the low glucose．

over training;MDA;superoxide dismutase;total antioxidant capacity;the protein expression of p38

G804.7

A

1004－0560(2011)01－0062－03

2010-10-25;

2010-11-15

李琳燕(1977－)，女，讲师，硕士，主要研究方向为运动生物化学。