牛IgG电化学纳米免疫传感器的研制

康晓斌，庞广昌*，梁新义

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

牛IgG电化学纳米免疫传感器的研制

康晓斌，庞广昌*，梁新义

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

研制特异性定量检测牛初乳制品及含牛IgG制品中牛IgG含量的电流型纳米免疫传感器。以成膜性及生物相容性良好的壳聚糖为媒介连接纳米金于玻碳电极，以比表面积大、吸附能力强、生物相容性好的纳米金固定兔抗牛IgG-HRP。通过循环伏安法及交流阻抗法表征电极组装各个过程的电化学特性，利用计时电流法测定PBS稀释的标准牛IgG。结果表明免疫前后稳定电流的变化率与标准牛IgG质量浓度的对数在0.1～10000ng/mL范围内线性相关，相关系数r=0.9976。该传感器稳定性及重现性良好，操作简单方便，成本较低，可用于含牛IgG制品中牛IgG含量的特异性定量检测。

牛免疫球蛋白G(牛IgG)；免疫传感器；纳米金；计时电流法

初乳是哺乳动物的母亲为新生动物所准备的第一份特殊早餐，初乳富含免疫球蛋白、抗菌肽和各种生长因子。其中免疫球蛋白对于婴幼儿的免疫、抗菌、抗病毒和促进免疫系统发育具有极其重要的作用。近年来实验表明，食用动物乳的抗体后，其主要的抗体并不被肠胃中的蛋白酶所消化，大部分可以保持到小肠末端还具有生物活性。可见奶中抗体的主要功能不是为后代提供营养物质，而是具有抗菌和免疫功能。在牛初乳和常乳中，IgG是最多最主要的免疫物质。因此富含IgG的婴幼儿奶粉及其他食物可以减少病毒和微生物的感染，并可以提高消费者的免疫能力。2004年，添加来源于牛乳的免疫球蛋白作为免疫活性物质的婴幼儿奶粉及其他食物的产值就高达10亿美元。在竞争日益激烈的IgG产品的市场中，产品的价格往往依赖于IgG的含量，并且对标注含量的要求越来越严格[1-3]。因此发展快速可靠的检测方法对添加IgG产品的质量控制颇为重要，表1为国内外现阶段对IgG的检测方法。

本项研究结合免疫分析无须对样品进行富集，纯化或预处理，特异性高及电化学分析可以实现在线检测，不受样品颜色、浊度的影响，所需仪器设备相对简单的特点，以玻碳电极为基体电极，采用自组装单分子膜技术借助纳米金固定Anti-bovine IgG-HRP，研制了牛IgG电流型免疫传感器，并对该传感器的电化学特性及测定效果进行了检测。

表1 近年来国内外对IgG的检测方法Table 1 Current detection methods for IgG at home and abroad

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯金酸 沈阳市金科试剂厂；壳聚糖(脱乙酰度≥90%) 济南海得贝海洋生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20 美国Sigma公司；标准牛IgG 北京成文免疫化学研究室；兔抗牛IgG-HRP 天津华生源生物科技有限公司；0.1g/100mL 壳聚糖溶液；0.1g壳聚糖溶于100mL体积分数1%醋酸溶液。所用试剂均为分析纯，实验所用水均为超纯水。

玻碳电极(glassy carbon electrode，GCE)(φ=3mm)、Ag/AgCl电极、铂丝电极 上海辰华仪器有限公司。1.2 仪器与设备

CHI760D电化学工作站 上海辰华仪器有限公司；KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DHG-907385-ⅢCIMO电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；PB-10 Sartorius pH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；LRH-70型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；UV-2501紫外可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司；DK-8B电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米金(gold nanpoarticle，NG)的制备及表征

本实验参照Frens法[11]采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备纳米金，参照文献[12]取调至中性的0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入1g/100mL柠檬酸三钠4mL混匀，置于微波炉中低火加热18min，待其冷却后用超纯水补充至原体积，保存于4℃备用。利用紫外可见分光光度计对所制纳米金溶胶进行表征。

1.3.2 免疫传感器的制备

将全新玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05μm粒径的α-Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后在超声水浴中清洗，每次30s，重复3次，最后依次用体积分数为50%HNO3、无水乙醇、和超纯水清洗。彻底洗净后，电极在1mol/L H2SO3溶液中用循环伏安法活化(扫描范围1.0～－1.0V，扫速为100mV/s)，反复扫描至出现稳定循环伏安曲线为止。最后记录在含0.20mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液的循环伏安曲线，以表征电极预处理效果(扫描范围0.6～－0.1V，扫描速度50mV/s)。实验室条件下所得循环伏安图中的峰电位差在80mV以下，并尽可能接近64mV，电极方可使用。在氮气环境中干燥待用。

取10μL 0.1g/100mL壳聚糖滴加于预处理电极表面的中心，于45℃烘箱中3h，冷却至室温后浸于1mol/L NaOH溶液中5min，超纯水清洗后浸于超纯水中30min。取出晾干后置于上述制备的纳米金溶胶中24h，即可得GCE/CHIT/NG电极。

将修饰电极浸泡于用0.01mol/L pH7.4 PBS稀释(1:100)的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG溶液中，放置过夜(4℃)，取出水洗；然后将该电极置于1g/100mL BSA溶液中37℃温育1h，以封闭活性位点，以含体积分数0.05% Tween-20的PBST溶液清洗未结合的BSA，晾干，即得GCE/CHIT/NG/anti-IgG-HRP电极，悬于缓冲液上方4℃保存备用。

1.3.3 免疫传感器测定方法

采用三电极系统，以不同修饰阶段的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，以含0.20mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液为测试底液。先用循环伏安法(扫描范围0.6～－0.1V，扫描速度50mV/s)表征电极在自组装过程中各个阶段的电化学特性，进一步用交流阻抗法(10-2～106Hz)进行表征。

对牛IgG的测定亦采用三电极系统，以0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液为测试底液，以2mmol/L对苯二酚及30% H2O2作为HRP酶的底物。在－400mV恒电位进行电流-时间扫描，以免疫反应前后稳定电流值(I1、I2) 变化率进行牛IgG的定量检测。

2 结果与分析

2.1 纳米金的UV-vis表征

本研究所制纳米金为透亮的酒红色，图1为纳米金在400～700nm波长范围的光谱扫描图，在519nm波长处有一很强的吸收峰，光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，且光吸收峰的波长(λmax)在510～550nm波长范围内随胶体金颗粒大小而变化。从而可知本研究制备的胶体金颗粒粒径在15nm左右[13]。

图1 纳米金溶胶光谱扫描图Fig.1 Absorption spectrum of nano-gold colloidal solution

2.2 电极预处理效果的表征

图2 电极预处理前后的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammogram of electrode before and after pre-treatment

电极打磨洗净后在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6(含0.20mol/L KNO3)溶液中的循环伏安图(扫描范围0.6～－0.1V，扫描速度50mV/s)如图2曲线a所示，其峰电位为Ep,a=0.297V，Ep,c=0.220V，峰电位差小于80mV且峰电流Ip,a=8.259μA，Ip,c=－9.141μA，Ip,a/Ip,c≈1，表明电极表面已处理光滑洁净；在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6(含0.20mol/L KNO3)溶液中的交流阻抗(10-2～106Hz)测定如图3曲线a所示，曲线近似为直线，表明电子传递到电极表面只受扩散控制。电极经H2SO4活化后可以在表面产生含氧带负电的基团(如羧基、羟基等)[14]，同时亦可使电极表面形成多孔结构，使其有效表面积增大[15]。如图2曲线b所示活化后电极氧化峰及还原峰均正移，Ep,a=0.399V，Ep,c=0.0.325V；且峰电流都有所增大，Ip,a=9.434μA，Ip,c=－9.204μA，Ip,a/Ip,c更接近1，说明H2SO4活化使电极表面带负电荷且提高了电极的性能。活化后电极的交流阻抗曲线(如图3曲线b)更趋于直线，更表明电极预处理效果良好。

图3 电极预处理前后的交流阻抗图Fig.3 AC impedance plot of electrode before and after pre-treatment

2.3 电极在组装过程中的电化学表征

2.3.1 循环伏安表征

图4 玻碳电极不同修饰阶段的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of glassy carbon electrode at different stages of modification

图4为不同修饰阶段电极在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6(含0.20mol/L KNO3)溶液中的循环伏安图(扫描范围0.6～－0.1V，扫描速度50mV/s)，由图4可见，以未修饰玻碳电极扫描时出现一对可逆的氧化还原峰(曲线a)，峰电位差为ΔE=65mV，Ip,a/Ip,c≈1；当电极上修饰一层壳聚糖后响应电流明显减小(曲线b)，表明壳聚糖已组装至裸玻碳电极上阻碍了电子的传递；当以纳米金进一步修饰电极后，峰电流值显著增加(曲线c)，这是因为纳米金有利于电子传递，表明纳米金已很好的固定在壳聚糖层；当电极再固定上anti-IgG-HRP后，由于生物大分子阻碍了电子的传输，致使峰电流较曲线c明显下降(图曲线d)；曲线e为anti-IgG-HRP与牛IgG免疫结合后的C-V图，其峰电流值进一步减小，归因于免疫复合物的形成进一步阻塞了电子传递的孔道。

2.3.2 交流阻抗表征

交流阻抗通过记录导体或半导体表面因固定生物分子或发生生物学反应而引起的载体表面的电容和界面电子传递电阻等电化学性质的变化，绘制阻抗谱，进而分析生物分子在载体表面的固定情况和生化反应的动力学过程[16]，故可借助交流阻抗技术进一步表征电极组装。图5为不同修饰阶段电极在含0.20mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液中的交流阻抗谱图，曲线a为裸电极交流阻抗图；曲线b为组装壳聚糖后，近似一段弧线，且其代表的圆的直径约为电子传递的阻抗(Ret)，表明阻抗明显增大，可能是由于壳聚糖在空间上阻碍了电子的传递，也进一步证明壳聚糖组装成功；由于纳米金优良的电子传递性能，当电极再修饰上纳米金后阻抗明显减小(曲线c)；曲线d较c阻抗增大，表明Anti-IgG-HRP已组装至电极上；当用BSA液封闭之后阻抗进一步增大(曲线e)，表明非特异性位点已被封闭；曲线f为免疫结合牛IgG之后的阻抗图，近似一段弧，较e阻抗明显增大，这可能是由于Anti-IgG-HRP与牛IgG免疫复合物的形成更大程度上阻碍了电子的传递。交流阻抗结果与循环伏安法结果一致，进一步证明本实验组装方法可行。

图5 玻碳电极不同修饰阶段的交流阻抗图Fig.5 AC impedance plots of glassy carbon electrode at different stages of modification

2.4 孵育时间优化

在37℃条件下对在牛IgG溶液中的孵育时间进行优化，结果如图6所示，孵育时间在0～10min之间响应电流随孵育时间的增加而急剧下降，当超过10min后响应电流下降缓慢，15min后响应电流基本恒定，故选择15min为最佳孵育时间。

图6 孵育时间优化Fig.6 Optimization of incubation time

2.5 免疫传感器对牛IgG的测定

将制备好的GCE/CHIT/NG/anti-IgG-HRP电极分别在PBS缓冲液倍比稀释的标准牛IgG溶液中37℃温浴15min(从低质量浓度至高质量浓度)，进行电流-时间扫描(图7)，经比较选定第50秒电流值为标准，以电流的变化率ΔI与牛IgG质量浓度C/(ng/mL)的对数做图(图8)，结果表明在0.1～10000ng/mL范围内呈线性关系，线性回归方程为：ΔI=7.1791lgC＋24.57913，相关系数r＝0.9976，据此可对受检抗原进行定量检测。

图7 免疫传感器对牛IgG测定的电流响应曲线Fig.7 Response curves of current for bovine IgG determination

图8 标准牛IgG测定的线性响应曲线Fig.8 Linear response curve of current for the determination of standard bovine IgG

2.6 免疫传感器的稳定性及重现性

将组装好的免疫传感器在同一质量浓度牛IgG标准液中连续测定12次，结果的RSD=3.45%(n=12)，表明该传感器稳定性良好。在PBS缓冲液上方、4℃条件下保存传感器，每隔3d对同一标准牛IgG溶液进行测定，结果如图9所示，前10d响应电流基本恒定，第13天响应电流为初始电流的86.59%，但第15天响应电流仅为初始值的47.83%。表明该免疫传感器至少可以稳定保存10d。

图9 保存稳定性实验Fig.9 Stability of sample current ratio during storage

分别取不同时间制备的5支免疫传感器，对同一质量浓度(1000ng/mL)标准牛IgG液进行检测，结果见表2，测定结果的RSD为4.78%，表明该免疫传感器重现性良好。

表2 重现性实验结果Table 2 Results of reproducibility experiments

3 结 论

以壳聚糖为桥联剂固定纳米金修饰于玻碳电极，利用纳米金对抗体优良的亲和作用制作出了一种测定范围广、检测限低的牛IgG电流型免疫传感器。该免疫传感器灵敏度高、稳定性及重复性较好，可快速、简单的用于牛IgG的定量检测。但保存的稳定性有待进一步研究，以便更好的应用于在线检测。

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Development of Nano-gold-modified Electrochemical Immunosensor for Bovine IgG

KANG Xiao-bin，PANG Guang-chang*，LIANG Xin-yi
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

A current-type nano-immunosensor was developed for the specific determination of immunoglobulin G (IgG) content in colostrum products and bovine IgG-containing products. The chitosan with excellent film-forming capability and biocompatibility was used as the medium to connect nano-gold and glassy carbon electrode. Due to its large surface area, strong adsorption capacity and good biocompatibility, nano-gold was used to immobilize rabbit anti-bovine IgG-HRP. Electrochemical properties of electrode surface during each fabrication procedure were characterized by cyclic voltammetry and alternating current impedance method and standard bovine IgG in phosphate buffer was determined by chronoamperometry. The results revealed that the current-type nano-immuosensor had an excellent linear relationship between the concentration of bovine IgG in the range of 0.1－10000 ng/mL and the change rate of stable current before and after immunization with a correlation coefficient of 0.9976.Moreover, this immunosensor proved stable, reproducible, easy to use and inexpensive, thus being applicable for the quality control of bovine IgG products.

bovine immunoglobulin G；immunosensor；nano-gold；chronoamperometry

TS252.7；O657.1

B

1002-6630(2011)16-0379-05

2011-05-26

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD04A00)

康晓斌(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为乳品安全及生物传感器。E-mail：kangxiaobin867100@163.com

*通信作者：庞广昌(1956—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术与食品免疫学。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn