rhddADAM15蛋白抑制小鼠黑色素瘤细胞生长及其机制

吴 静，雷艳丽，金 坚，邬敏辰，陈 伟

(江南大学1.医药学院，2.工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

金属蛋白酶去整合素家族(A disintegrin and metalloproteinase，ADAM)是近年来新发现的一类在哺乳动物中广泛表达的跨膜糖蛋白家族，具有降解细胞外基质、释放细胞因子和介导信号转导等多种生物学功能［1］。在已发现的30多种ADAM家族成员中，ADAM15在人类多种实体瘤细胞(如乳腺癌、前列腺癌和直肠癌等)中过量表达;该蛋白包含7个功能结构域:前导域、类金属蛋白酶功能域、去整合素功能域、富含半胱氨酸功能域、类表皮生长因子功能域、跨膜域和C端的胞质尾区，其中去整合素结构域中含有整合素(Integrin)家族蛋白的特异识别序列〔RGD序列(Arg-Gly-Asp)〕，具有典型的药物分子靶点结构与特征，有望用于指导抗肿瘤药物的研究与开发［2］。有研究报道ADAM15与黑色素瘤细胞转移和新生血管的形成密切相关［3-5］，但是国内外关于 ADAM15对黑色素瘤细胞作用机制的研究报道并不多见。由于天然来源的ADAM15蛋白十分有限，获得大量具有生物活性的重组ADAM15或其片段蛋白对深入研究ADAM15在肿瘤发展变化中的作用机制，指导新型靶向抗肿瘤药物的研制具有重要意义。作者在前期研究工作中，已经报道了制备重组人ADAM15去整合素结构域蛋白(rhddADAM15)的方法［6］。本文以小鼠黑色素瘤细胞(B16)为研究模型，采用经典分析方法，解析rhddADAM15对B16细胞体外增殖、迁移、侵袭和细胞周期等行为的影响，并初步检测了rhddADAM15作用引起的B16细胞中p38MAPK激酶活性的变化，对rhddADAM15的作用机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和细胞株 重组人rhddADAM15由本实验室制备，RPMI 1640培养基购自Gibco公司，MCDB-131培养基、牛血清白蛋白(BSA)、青霉素和链霉素等均购自Sigma公司，噻唑兰(MTT)购自Biomol公司，Matrigel基质蛋白购自BD公司，侵袭小室Millicell购自Millipore公司，胰酶、碘化丙啶(PI)和RNA酶A均购自凯基生物公司，半胱天冬酶(caspase)-9抑制剂Z-LEHD-FMK、caspase活力检测试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司。小鼠黑色素瘤细胞(B16)购自中科院细胞库，保存于液氮罐中。人微血管内皮细胞(HMEC-1)由法国国家卫生医药研究院U553研究所(INSERM U553)陆核教授馈赠，保存于液氮罐中。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 B16细胞采用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基(1×105U·L-1的青霉素和100 mg·L-1链霉素)，37℃，5%CO2培养箱中常规培养。培养至所需细胞量时，倾去培养液，加入5 ml 0.25%胰酶溶液消化，37℃保温至细胞开始从瓶壁脱落前，倾去胰酶溶液，加入适量以上培养基，用玻璃吸管吹打至细胞全部从瓶壁脱落;血球计数板计数细胞，用培养基稀释细胞浓度至0.8×108～1.0×108·L-1;铺于96孔细胞培养板，每孔加100 μl细胞悬液，37℃，5%CO2培养箱中常规培养24 h后备用。HMEC-1细胞采用含10%小牛血清的MCDB-131 培养基(含 10 μg·L-1EGF，1 mg·L-1氢化可的松)，37℃，5%CO2培养箱中常规培养，同上常规培养及处理

1.2.2 MTT法测定rhddADAM15对细胞增殖的抑制 将rhddADAM15以培养基稀释至系列浓度(0、2.5、5、7.5、10、12.5 和 15 mg·L-1)，加入培养至24 h的96孔细胞培养板，每浓度点设4个复孔，同时设置空白孔及阴性对照孔，每实验孔均以培养基补至300 μl，培养24 h;小心吸去上清液，每孔加入180 μl新鲜培养基，再加 20 μl MTT 溶液(5 g·L-1，即0.5%MTT)，继续培养4 h;终止培养，小心吸去孔内培养液;每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值(A570nm)。按以下公式计算平均抑制率:抑制率/%=(1-给药组A570nm/对照组A570nm)×100%。绘制不同加药浓度下的细胞生长抑制曲线，计算药物对细胞的半数抑制浓度IC50(抑制率为50%时药物的浓度)。

1.2.3 细胞迁移试验 采用划痕实验检测rhdd-ADAM15对B16细胞迁移的影响［7］，无血清培养液培养细胞24 h使细胞生长同步化，再转入全培养液培养细胞至对数生长期时，胰酶消化，24孔培养板每孔加入细胞5×105个，培养24 h，用无菌枪头沿孔中心划出约1 mm宽“伤痕”，PBS冲洗干净，加入培养液稀释的不同浓度的rhddADAM15(0、5、7.5和10 mg·L-1)，每隔12 h观察两边细胞向中间迁移的情况并拍照。

1.2.4 细胞侵袭试验 采用经典的Albini侵袭小室检测rhddADAM15对 B16细胞体外侵袭的影响［8］:在4℃融解Matrigel基质蛋白胶，铺于 millicell侵袭小室上下室之间的聚碳酸酯微孔膜上，备用。8%的胎牛血清(FBS)，置入侵袭小室的下室作为趋化因子液。细胞培养至对数生长期时，消化离心，PBS洗3次，台盼蓝染色检测细胞活力95%以上，用含有不同浓度的 rhddADAM15(0、2.5、5、7.5 和10 mg·L-1)培养液稀释细胞至5×108·L-1，每个侵袭小室上室中加入含不同浓度rhddADAM15的细胞悬液200 μl(105个细胞)，置于培养箱中培养12 h，取下微孔膜，用乙醇棉球擦尽上表面细胞后，甲醛固定，苏木精染色。显微镜下观察穿入膜内细胞，计数中间及四周5个高倍(400倍)镜下视野细胞数，计算平均数。每组细胞5个样本，计算平均数进行比较。

1.2.5 rhddADAM15对细胞周期分布的影响 分别收集不同浓度rhddADAM15药物组(0、5、7.5和10 mg·L-1)和空白对照组培养24 h后的B16细胞，移至10 mL的锥形管中，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清。PBS洗涤2次，用500 μl的PBS重悬细胞。台盼蓝染色检测细胞活力。然后加入5 ml 70%冷乙醇4℃固定过夜。1 000 r·min-1离心5 min，弃乙醇。旋搅沉淀，用5 ml PBS+1%小牛血清清洗2次。用含1%小牛血清的800 μl PBS重悬细胞沉淀。加200 μl PI染色液和RNA酶A37℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测，每次计数105个细胞，用Cell Quest采集数据，ModFit LT3.0软件分析细胞周期及凋亡峰。

1.2.6 Caspase酶活力测定 将细胞培养至对数生长期，加入rhddADAM15使终浓度为7.5 mg·L-1分别于0、12、24和36 h收集细胞。按照试剂盒提供方法测定caspase酶活力。

1.2.7 Caspase-9抑制剂对rhddADAM15抑制细胞生长的影响 按“1.2.1”方法培养细胞，加入终浓度为12 μmol·L-1的Z-LEHD-FMK共培养2 h后，加入rhddADAM15使终浓度为0、5、7.5和10 mg·L-1，继续培养24 h，按1.2.2方法测定抑制率。

1.2.8 B16细胞p38 MAPK激酶活性测定

1.2.8.1 制备B16细胞裂解液 B16细胞同步化后培养至对数生长期，培养液中加入rhddADAM15至不同终浓度 (0、5、7.5和10 mg·L-1)，继续培养24 h后，EDTA消化，收集大量B16细胞，PBS洗涤细胞数次，加入4℃预冷的细胞裂解缓冲液(1%Triton X-100，1%NP-40，0.125 mol·L-1EDTA，0.1 mmol·L-1PMSF，150 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1Tris-Cl，pH 7.4，0.1%完全蛋白酶抑制剂)，冰浴下将细胞与玻璃珠悬浮混匀，剧烈振荡，重复数次，静置30 min，离心(4℃ ，12 00 r·min-1，20 min)，收集上清混合蛋白质溶液，备用。

1.2.8.2 p38MAPK激酶活性测定 Bradford法测定蛋白浓度，各取蛋白40 μg变性，SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，TBST缓冲液(5%脱脂奶粉)封闭1 h。NC膜分别与p-p38单克隆抗体(1∶1 000)或兔抗p38MAPK多克隆抗体(1∶1 000)4℃下孵育过夜，TBST洗涤4次，加入相应的二抗37℃孵育2 h，TBST洗涤3次，加入DAB显色液显色，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值，每组实验重复3次。

1.2.9 数据处理 用SPSS13.0统计软件进行分析，两样本均数比较用t检验，细胞抑制试验重复3次以上，生长抑制率与药物浓度的关系用直线回归与相关分析，细胞侵袭和迁移试验、细胞周期检测和p38MAPK激酶活性试验重复2次以上，分别拍照或测定相关值。

2 结果

2.1 rhddADAM15抑制肿瘤细胞及内皮细胞的生长 MTT法检测显示rhddADAM15可以体外抑制内皮细胞HEMC-1和肿瘤细胞B16的生长，抑制作用随着rhddADAM15浓度的增加而增强，呈现浓度依赖性，IC50分别为18.02和13.80 mg·L-1。另一方面，当rhddADAM15浓度为7.5 mg·L-1时，rhdd-ADAM15对 B16细胞的抑制率比 HMEC-1高出81.3%(P＜0.01)。这一结果表明，同一浓度的rhddADAM15对肿瘤细胞生长的抑制作用强于内皮细胞，差异具有显著性，从而证实了rhddADAM15具有体外抑制肿瘤细胞增殖的生物功能。为排除rhdd-ADAM15对B16细胞迁移和侵袭的作用是由于细胞活力受抑制引起的，实验中采用的药物浓度是2.5、5、7.5 和 10 mg·L-1。

Fig 1 Curves of the inhibitory rate of rhddADAM15 on HMEC-1 and B16 cells(24 h，n=4)

2.2 rhddADAM15抑制B16细胞的侵袭和迁移

Albini侵袭小室实验结果表明rhddADAM15可明显抑制B16细胞对Matrigel基质胶的破坏作用，从而阻止细胞的侵袭，随着rhddADAM15浓度的增加，进入微孔膜中的细胞数量明显下降，当rhddADAM15浓度为7.5和10 mg·L-1时，与对照组(未添加rhddADAM15)比较，侵袭细胞数量分别下降了0.55和0.87。另一方面，划痕实验表明rhddADAM15对B16细胞迁移也有明显抑制作用。rhddADAM15(7.5 mg·L-1)与B16细胞共培养12和24 h时，与对照组比较，对细胞迁移的抑制作用与时间成正比。

Fig 2 Inhibitory effect of rhddADAM15 on the invasion of B16 cells(12 h，n=5)

Fig 3 Inhibitory effect of rhddADAM15(7.5 mg·L－1)on the migration of B16 cells(×40).(n=3)

2.3 rhddADAM15对B16的细胞周期的影响 如Tab 1所示，与对照组相比，rhddADAM15作用使得S期细胞数量减少，G2/M期细胞的数量增加，而且这种影响呈现出浓度依赖型，但在实验结果中的凋亡现象并不明显。

Tab1 Effect of rhddADAM15 on B16 cell cycle distribution(±s，n=4)

Tab1 Effect of rhddADAM15 on B16 cell cycle distribution(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

rhddADAM15/mg·L-1 Cell cycle distribution/%G0/G1 S G2/M Control 60.67±12.31 29.39±6.43 9.94±2.32 5 63.24±9.41* 20.45±4.33* 16.31±4.29*7.5 67.46±17.14* 9.43±2.50* 23.11±5.20*10 66.83±15.46＊＊ 4.40±1.09＊＊28.77±5.87＊＊

2.4 rhddADAM15对B16细胞中Caspase酶活力的影响及caspase-9抑制剂对rhddADAM15作用的干扰 如Tab 2所示:rhddADAM15在浓度为7.5 mg·L-1时对B16细胞中caspase-3和 caspase-9酶活力的影响并不明显，只是在作用36 h后有一定升高。另外，caspase-9抑制剂可部分降低 rhddADAM15对细胞生长的抑制作用，与未添加caspase-9抑制剂的对照组相比，rhddADAM15(5、7.5和10 mg·L-1)作用抑制率分别降低了1.6%、2.3%和5.1%(P＜0.05)。

Tab 2Effect of rhddADAM15 on caspases in B16 cells(±s，n=4)

Tab 2Effect of rhddADAM15 on caspases in B16 cells(±s，n=4)

*P＜0.05 vs control

Time/h Enzyme activity/U caspase-3 caspase-9 0 2.54±0.67 0.19±0.03 12 2.30±0.41 0.25±0.04 24 3.27±0.64 0.29±0.05 36 5.83±0.46* 0.50±0.07*

2.5 rhddADAM15对B16细胞中p38激酶活性的影响 Western blot结果如Fig 4所示:p-p38表示被激活的p38激酶，随着rhddADAM15浓度的不断增加，p38激酶磷酸化水平不断增高，p-p38/p38的比例升高，当rhddADAM15为10 mg·L-1时，p38激酶的磷酸化程度达0.80，但总的p38激酶表达水平并不随rhddADAM15浓度的增加而增加，对照组p38激酶磷酸化不明显。

3 讨论

肿瘤细胞转移包括肿瘤生长侵袭、细胞脱落进入循环流动、与脉管内皮或组织基质黏附、通过组织和间隙变形移动、降解破坏细胞间质和定植生长等主要过程。侵袭转移是肿瘤恶性程度的重要生物学特性和影响肿瘤预后的主要因素，因此对侵袭转移机制的深入研究对肿瘤治疗方案的选择和判断预后具有重要的意义。已有研究表明，rhddADAM15具有抑制乳腺癌MDA-MB-231肿瘤细胞生长和肿瘤新生血管形成的功能，对接种B16肿瘤小鼠的肺转移具有明显的抑制作用［4］，还可以通过与细胞表面整合素α5β1的相互作用抑制细胞转移［9］。本研究结果发现rhddADAM15对B16细胞体外增殖表现出明显的抑制作用，并呈浓度依赖性抑制细胞侵袭，时间依赖性抑制细胞迁移，这与文献报道的结果一致，其抑制肿瘤细胞侵袭转移的机制可能与影响细胞间相互识别以及细胞与细胞基质之间的相互作用有关。

Fig 4 p38 activation in B16 cells incluced by rhddADM15(24 h，n=3).*P＜0.05 vs control(0 mg·L-1)

肿瘤细胞最基本的特征是细胞平衡机制失衡。细胞不受控制地异常增殖，而失控性增殖的根本原因就在于细胞周期的监控机制——细胞周期检查点被破坏，导致细胞增殖、分化和死亡机制的紊乱，因此，选择能同时破坏细胞并引起凋亡的药物，以调节细胞周期将是今后高效治疗肿瘤的新策略［10］。在研究rhddADAM15作用对细胞周期影响时发现，rhddADAM15主要是将B16细胞阻滞在G2/M期，从而延缓细胞生长速度，使得细胞体外增殖受到明显抑制，但没有发现直接证据表明rhddADAM15能够促使B16细胞产生坏死或凋亡的现象，提示rhdd-ADAM15对B16细胞生长的抑制作用可能不是通过直接诱导细胞凋亡实现的。进一步研究rhddADAM15对细胞凋亡的主要执行蛋白caspase蛋白酶活力的影响，发现随着作用时间的延长(36 h)，caspase酶活性有一定提高，但不明显，同时caspase酶抑制剂可以部分降低较高浓度rhddADAM15(10 mg·L-1)对 B16细胞生长的抑制作用，提示caspase信号通路可能参与了rhddADAM15诱导的B16细胞死亡，但具体作用方式还有待深入研究。Trochon-Joseph等［4］研究重组表达的 ADAM15去整合素蛋白片段(RDD)对牛肺动脉内皮细胞(CPAE)凋亡的影响时，也发现该蛋白对诱导细胞凋亡现象不明显;Böhm等［11］则报道 ADAM15对骨关节炎软骨细胞具有抗凋亡作用，与本文的结果相似。

真核细胞中，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路担负着将胞外各种有丝分裂和应急信号传递至胞核，并调节基因表达的重要使命，在细胞恶变和肿瘤发生中起着重要的调控作用。通过调节不同MAPK通路的活性可控制细胞的存活与死亡。p38信号通路是MAPK通路的重要分支，已有研究表明，p38通路在调控细胞生长、激活G2期检测点、引起G2/M期阻滞中发挥重要作用:Afrasiabi等［12］研究神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)抑制甲状腺癌细胞的增殖和迁移时发现，随着G2/M的细胞数量明显增加，MAPK信号通路成员的磷酸化水平明显降低，表明SPC的抑制作用是通过调节MAPK信号通路来实现的;然而，关于ADAM15与p38信号通路相关性的报道则很少:ADAM15通过抑制Erk通路引起细胞表面整合素α5β1聚集而抑制细胞的转移和侵袭，通过调节Src/ERK1/2 信号通路调控中性粒细胞迁移信号［9，13］;另一方面，p38蛋白激酶级联的信号传递是通过蛋白质的磷酸化来完成的。如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)对血管内皮细胞的p38MAPK的激活是通过一种有序的激酶级联(MAPKKK→MAPKK→MAPK)而实现的。改变蛋白激酶信号分子的某个(些)氨基酸，会影响其三维结构，从而激活或抑制信号分子的生物学活性。在本研究结果中，rhddADAM15作用使p38激酶磷酸化而激活，随着rhddADAM15浓度的提高，p38激酶磷酸化程度加强，活性增强，提示p38MAPK信号通路可能参与了rhddADAM15调控B16细胞行为的过程。但是 rhddADAM15激活p38信号通路的级联激活过程还有待后续研究中进一步阐明，同时在上述实验结果的基础上，我们还将继续研究rhddADAM15调控p38MAPK信号通路的机制，如p38激酶特异性抑制剂的阻断是否影响rhddADAM15对B16细胞行为的调控等。

［1］Lucas N，Najy A J，Day M L.The therapeutic potential of ADAM15［J］.Curr Pharm Des，2009，15(20):2311-8.

［2］Lucas N，Day M L.The role of the disintegrin metalloproteinase ADAM15 in prostate cancer progression［J］.J Cell Biochem，2009，106(6):967-74.

［3］Ungerer C，Doberstein K，Bürger C，et al.ADAM15 expression is downregulated in melanoma metastasis compared to primary melanoma［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，401(3):363-9.

［4］Trochon-Joseph V，Martel-Renoir D，Mir L M，et al.Evidence of antiangiogenic and antimetastatic activities of the recombinant disintegrin domain of metargidin［J］.Cancer Res，2004，64(6):2062-9.

［5］林 菁，彭华毅.黄癸素诱导小鼠黑色素瘤B16细胞凋亡的研究［J］.中国药理学通报，2010，26(12):1630-4.

［5］Lin J，Peng H Y.Apoptosis of B16 melanoma cells induced by berberine α-hydroxy-β-decanoylethyl sulfonate［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(12):1630-4.

［6］Wu J，Zhang L，Lei J，et al.Enhancement of recombinant human ADAM15 disintegrin domain expression level by releasing the rare codons and amino acids restriction［J］.Appl Biochem Biotechnol，2009，157(2):299-310.

［7］Hwang E S，Kim G H.Allyl isothiocyanate influencesin vitroinvasion，adhesion and gene expression in SK-Hep1 cells［J］.J Nutr Biochem，2006，231(23):421-30.

［8］Albini A，Iwamoto Y，Kleinman H K，et al.A rapidin vitroassay for quantitating the invasive potential of tumor cells［J］.Cancer Res，1987，47(12):3239-45.

［9］Chen Q，Meng L H，Zhu C H，et al.ADAM15 suppresses cell motility by driving integrin alpha 5 beta1 cell surface expression via Erk inactivation［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40(10):2164-73.

［10］Kastan M B，Bartek J.Cell-cycle checkpoints and cancer［J］.Nature，2004，432(12):316-23.

［11］Böhm B，Hess S，Krause K，et al.ADAM15 exerts an antiapoptotic effect on osteoarthritic chondrocytes via up-regulation of the X-linked inhibitor of apoptosis［J］.Arthritis Rheum，2010，62(5):1372-82.

［12］Afrasiabi E，Blom T，Balthasar S，et al.Antiproliferative effect of sphingosylphosphorylcholine in thyroid FRO cancer cells mediated by cell cycle arrest in the G2/M phase［J］.Mol Cell Endocrinol，2007，274(1-2):43-5.

［13］Sun C，Wu M H，Guo M，et al.ADAM15 regulates endothelial permeability and neutrophil migration via Src/ERK1/2 signalling［J］.Cardiovasc Res，2010，87(2):348-55.