二十碳五烯酸高产菌株的诱变选育及柠檬酸对其油脂合成的影响

胡静荣

(华中科技大学生命科学与技术学院资源生物学与生物技术研究所，湖北武汉，430074)

二十碳五烯酸高产菌株的诱变选育及柠檬酸对其油脂合成的影响

胡静荣

(华中科技大学生命科学与技术学院资源生物学与生物技术研究所，湖北武汉，430074)

利 用UV-LiCl复合诱变腐霉出发菌株，通过低温培养和苏丹Ⅱ染色镜检初筛、摇瓶发酵复筛，获得1株二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)高产菌株腐霉H6，经20℃ － 15℃二阶段培养168 h，所得生物量、油脂含量和EPA含量分别为23.50 g/L、17.54%和15.36%，EPA产量为633.17 mg/L，较出发菌株(263.80 mg/L)提高了140.02%，且产量、性状稳定。添加不同浓度柠檬酸对腐霉H6油脂合成调控的研究表明，发酵中期添加1.5 g/L柠檬酸可显著增加葡萄糖的利用率，提高油脂含量和EPA含量，EPA产量达890.49 mg/L，与对照相比提高40.64%。发酵实验表明腐霉H6极有潜力开发成为工业化生产菌种。

二 十碳五烯酸，腐霉，复合诱变，柠檬酸，代谢调控

5，8，11，14，17-顺式-二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-cis-Eicosapentaenoic acid，EPA)是一种 ω-3 系列多不饱和脂肪酸，是维持大脑、视网膜等正常功能和生长发育的必需脂肪酸。它具有重要的生理活性功能，可以降低血脂、预防动脉硬化等心血管疾病［1－2］，并具有抗癌［3］、抗炎［4］等作用。目前，生产 EPA 的唯一商业来源是鱼油，但深海鱼油资源有限、成分复杂，并存在重金属、农药残留等问题［5］。而微生物发酵生产EPA具有脂肪酸组成简单，合成周期短，不受环境、季节、气候影响等优点，成为近年来研究热点。

作为生产EPA的替代来源，真菌、海洋细菌和微藻备受关注，主要包括畸雌腐霉(Pythium irregulare)［6］、腐败希瓦式菌(又称腐败交替单胞菌 Shewanella putrefaciens)［7］、硅藻(Diatom nitzschia)［5］、微小小 球 藻 (Chlorella minutissima)［8］、三 角 褐 指 藻(Phaeodactylum tricornutum)［9］等。日本 Shimizu 等利用高山被孢霉(Mortierella alpina)通过外源添加亚麻籽油12℃培养9 d，再经过休止细胞处理7 d，EPA产量达1.88 g/L［10］，但由于发酵周期较长，EPA 含量较低等问题，仍未实现产业化。腐霉(Pythium)是藻状菌纲霜霉目的真菌，Gandhi和Weete于1991年发现某些腐霉属真菌可以产生EPA［11］，且具有培养设备较简单，产物分离纯化容易等优势。本文以腐霉为出发菌株，进行UV-LiCl复合诱变筛选，并研究外源添加柠檬酸对EPA发酵的调控作用。

1 材料和方法

1.1 菌种及培养基

腐霉(Pythium):由华中科技大学生命科学院资源生物学与生物技术研究所筛选，4℃保藏于PDA斜面，每2 个月转接1 次［12］。

诱变培养基:PDA培养基。种子培养基(g/L):葡萄糖 80、酵母粉 6、MgSO40.05，pH 值5.0。发酵培养基(g/L):葡萄糖 100、酵母粉 5、NaNO33、KH2PO42、MgSO40.05，pH 5.0。121℃灭菌 20 min。

1.2 诱变选育

取保藏的斜面菌种，小心挑取适量菌丝，转接于装有80 mL PDA培养基的250 mL三角瓶中活化，20℃培养120 h后，加入50 mL含有数粒无菌玻璃珠的0.5%LiCl溶液振荡处理0.5 h，经3层无菌纱布过滤，制成孢子悬液，梯度稀释至10－3，取0.2 mL涂平板，置于波长253.7 nm，功率30 W的紫外灯下，分别照射不同时间(0、60、120、180、240、300、360 s)后，于15℃黑暗培养，120 h后初筛挑取菌落较大的菌株，染色后镜检选择含油率较高的菌株。再进行液体摇瓶发酵复筛。

1.3 菌体培养

用0.9%NaCl溶液制成孢子悬液(方法同1.2)，取8 mL接种于装有80 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，25℃，180 r/min振荡培养48 h，然后以接种量10%转接于装有80 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，20℃，180 r/min振荡培养96 h后，培养箱程序降温至15℃继续培养至168 h后收集菌体。为考察柠檬酸对EPA发酵的影响，菌体培养至72 h，分别向发酵液中添加终浓度为 0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的柠檬酸，培养方法不变。每个样品均有3个重复。

1.4 分析方法

油脂含量定性分析，利用苏丹Ⅱ染色制片镜检，取PDA平板培养的菌丝少许，置于10 mL的小试管中，加入苏丹Ⅱ染色液(0.5%苏丹Ⅱ乙醇溶液)2 mL于20℃染色10 min，取出菌丝用蒸馏水洗涤2次，挑取菌丝制作临时装片，400倍显微镜下观察。选取脂肪滴大且分布较多的菌株。

生物量测定，采用抽滤收集菌丝体，蒸馏水冲洗3次，置于80℃烘箱6～8 h干燥至恒重后称量。油脂提取按照Bligh和Dyer总油脂快速提取法［13］，油脂于50℃氮气环境下干燥后称重，样品甲酯化［14］后，采用浙江福立分析仪器厂9790气相色谱仪进行脂肪酸甲酯组分分析，仪器配备交联FFAP 35 m×0.25 mm石英毛细管柱以及FID检测器。与脂肪酸甲酯标准品对照确定油脂成分，面积归一化法进行定量分析。实验数据由软件Microsoft Excel处理。

2 结果与讨论

2.1 腐霉EPA高产菌株的诱变选育

采用LiCl与紫外线复合处理对腐霉进行诱变，共涂布84个平板，初筛挑取在相对低温(15℃)生长较快的菌株，再通过苏丹Ⅱ染色制片镜检，细胞内的脂肪滴被染成红色，见图1，图2。

图1 腐霉出发菌株菌丝染色镜检(400倍)

选取脂肪滴较大分布较多的菌株作复筛。对初筛所得9个菌株进行复筛由图3结果可以看出，其中8株菌的生物量、油脂含量均有提高，7株菌的EPA产量均高于出发菌株，编号为H6的菌株生物量、油脂含量和EPA含量分别达23.50 g/L、17.54%和15.36%，分别较出发菌株提高了14.54%、33.16%、55.18%。其EPA产量为633.17 mg/L，较出发菌株(263.80 mg/L)提高了140.02%。将菌株H6在PDA培养基上继代培养数次，摇瓶发酵结果表明该菌株的产量性能基本稳定。

图2 腐霉H6菌丝染色镜检(400倍)

图3 初筛所得9菌株液体摇瓶复筛生物量、油脂含量和EPA产量与出发菌株比较

LiCl是一种碱金属卤化物，其本身几乎无诱变作用，但Li+可以限制RNA水解酶的活性，减慢转录，与一些诱变因子具有协同作用［15］。采用LiCl对孢子前处理，有利于突变的发生。诱变筛选实验结果表明，UV-LiCl复合诱变是筛选腐霉EPA高产菌株的有效方法。较低温度下，不饱和脂肪酸的含量增加从而增强细胞膜的流动性，是微生物对冷环境适应的结果［16］。但随着温度的降低，微生物生长受到抑制。因此，通过诱变选育在相对低温(15℃)生长快速的菌株，既能提高菌体中油脂的不饱和度、又不影响发酵周期。苏丹Ⅱ染色镜检观察作为一种半定量法，操作简便，可以得到含油率较高的菌株。摇瓶复筛结果表明该初筛方法具有较高的筛选效率。

2.2 外源柠檬酸对油脂合成的影响

为进一步提高菌体的油脂含量及EPA产量，进行了腐霉发酵调控研究。发酵至72 h分别添加0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L 柠檬酸结果表明(表 1)，添加适量柠檬酸有助于提高葡萄糖的利用率，增加菌体油脂积累和EPA的转化。添加柠檬酸的最适添加浓度是1.5g/L，葡萄糖的利用率、油脂含量和菌体中EPA含量分别为73.81%、18.66%和3.62%(表1)，与对照相比分别增加了9.12%、6.39%和34.57%，油脂中EPA含量由15.36%(图4)提高至19.42%(图5)，EPA产量达890.49 mg/L，与对照相比提高了40.64%。

表1 不同柠檬酸含量对EPA摇瓶发酵的影响

柠檬酸是三羧酸循环的早期中间产物，柠檬酸含量较高时，反馈抑制丙酮酸激酶活性，并通过加强ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶的活力。由于丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途径的关键酶，所以发酵培养基中添加适量柠檬酸可以减弱EMP途径代谢流量，从而增加HMP途径代谢流量［17］，增加NADPH的产生，为合成脂肪酸提供还原力。同时，柠檬酸促进无活性的乙酰CoA羧化酶单体聚集成有活性的全酶，促进丙二酸单酰CoA的合成，从而加速脂肪酸的合成。根据腐霉生长规律，菌体培养至72 h进入稳定期，此时菌体生长基本完成，向发酵液中添加柠檬酸，有利于油脂合成及EPA转化。但添加柠檬酸超过1.5 g/L，生物量降低，不利于EPA产量的提高，推测由于柠檬酸浓度过高，抑制菌体生长所致。

图4 腐霉H6基本培养基发酵所得脂肪酸甲酯GC分析

3 小结

出发菌株腐霉经过UV-LiCl复合诱变，固体平板低温培养、苏丹Ⅱ染色镜检初筛，得到相对低温下生长快速且含油率高的菌株，通过液体摇瓶发酵复筛，得到菌株腐霉H6，其EPA产量达633.17 mg/L，较出发菌株提高了140.02%。结果表明，此种筛选方法简便、快速、有效。柠檬酸对腐霉油脂合成的调控研究结果表明，添加1.5g/L柠檬酸可以促进葡萄糖的消耗，增加油脂含量和 EPA含量，250 mL摇瓶中EPA产量可达890.49 mg/L。以后应进一步探讨代谢调控的精准控制，并研究腐霉发酵的放大规律，逐步实现EPA发酵的产业化运用。

图5 腐霉H6发酵中期添加1.5 g/L柠檬酸所得脂肪酸甲酯GC分析

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Mutation Breeding of High Yielding Strain of Eicosapentaenoic Acid and Effect of Citric Acid on the Lipid Synthesis

Hu Jing-rong
(Institute of Resource Biology and Biotechnology，College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)

The original strain Pythium was mutated by UV combined with LiCl.After preliminary screening by low－temperature culturing and microscope observation after SudanⅡ staining，and re-screening by shake flask fermentation，a high－yielding eicosapentaenoic acid－producing strain Pythium H6 was obtained.Its biomass，oil and EPA content was 23.5 g/L，17.54%and 15.36%respectively after two stages of 15～20℃ culture for 168h.In addition，the EPA production of H6 was 633.17 mg/L，which was 140.01%higher than the original strain，and the product character was stable.The study of the lipid synthesis of Pythium H6 exposed to different concentrations of exogenous citric acid indicated that adding 1.5 g/L citric acid to fermentation medium can significant increase its glucose utilization，lipid and EPA content with EPA yield up to 890.49 mg/L，40.64%higher compared to the control.Fermentation experiments suggested that Pythium H6 has the potential to be developed into a highly industrial production strain.

Eicosapentaenoic acid，Pythium，composite mutation，citric acid，metabolic regulation

硕士研究生。

*国家自然基金项目(No.20776058)资助

2010－09－09，改回日期:2010－10－10