重组草酸脱羧酶的表达及酶学性质研究*

林日辉，许丽莉，农勉，张陆成

(广西民族大学化学与生态工程学院，化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室，广西南宁，530006)

重组草酸脱羧酶的表达及酶学性质研究*

林日辉，许丽莉，农勉，张陆成

(广西民族大学化学与生态工程学院，化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室，广西南宁，530006)

研 究了重组草酸脱羧酶的表达及其酶学性质。经IPTG诱导，每克湿重菌体收获草酸脱羧酶活力820 U，经Ni－NTA亲和层析酶液纯化2.07倍，酶活力回收60.38%。酶促反应的最适温度为50～55℃，最适pH值为3.5，添加EDTA及Fe2+对酶活力有促进作用，Mn2+抑制酶活。在pH4.0，温度37℃下Km值为14.53 mmol/l，Vmax 为 1 33.33 U/mg。

草 酸脱羧酶，诱导表达，纯化，酶学性质

1 材料与方法

1.7 蛋白浓度和酶活力测定

蛋白浓度采用考马斯亮蓝法测定。

草酸脱羧酶活力测定采用终止反应法［12］。反应液含 0.115 mol/L 草 酸 钾，80 μmol/L MnCl2，50 mmol/L pH值4.0柠檬酸缓冲液，加入草酸脱羧酶液开始反应，10 min后加入等体积的 0.2 mol/L K2HPO4终止反应。过0.20 μm微孔膜除去酶蛋白，采用液相色谱法(HPLC)检测反应生成的甲酸。色谱柱为 Aminex○Rresin－based 87H 柱，柱温 65 ℃;流动相为 0.004 mol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min;紫外检测器210 nm检测;进样量20 μL。酶活单位定义为:每分钟催化转化草酸产生1 μmol甲酸的酶量。

1.8 酶学性质

以纯化的草酸脱羧酶为对象，分别研究其最适pH值和pH稳定性、最适温度和热稳定性、金属离子和EDTA对酶活力的影响，以及草酸脱羧酶的动力学常数。

2 结果与分析

2.1 草酸脱羧酶的表达、纯化

经IPTG诱导及破碎细胞提取后，每克湿重菌体细菌收获草酸脱羧酶活力820 U(比活力1.82 U/mg)。层析分离结果如图1所示。

图1 酶粗提液亲和层析洗脱曲线

由图1可见，粗提液中蛋白按无吸附、弱吸附、较强吸附3阶段洗出。酶活检测表明，草酸脱羧酶酶活存在于强吸附的分级收集液中。这是由于重组草酸脱羧酶具有6个组氨酸标志，与层析柱Ni2+吸附较强。部分分级洗脱液 SDS－PAGE结果见图2。SDSPAGE表明重组草酸脱羧酶亚基分子量约44 ku，与文献报道相符［9］。粗酶液经 Ni－NTA亲和层析一步纯化，草酸脱羧酶比活提高2.07倍，酶活回收为60.38%。SDS－PAGE 结果也表明，Ni－NTA 亲和层析纯化酶液中尚有少量杂质，后续实验需采用其他手段(如凝胶过滤)进一步纯化。

图2 亲和层析分级酶液SDS－PAGE图

2.2 HPLC法检测甲酸

本研究涉及金属离子和不同pH对草酸脱羧酶的影响，文献中大多报道利用甲酸脱氢酶偶联法检测草酸脱羧酶催化生成的甲酸，该法的分析结果可能会受到第一个反应的pH或金属离子影响。为了避免干扰，采用HPLC直接检测。HPLC对草酸脱羧酶催化反应液的分离及检测结果见图3。可见草酸脱羧酶催化反应体系简单，通过HPLC可以有效分离产物甲酸(13.274 min)、反应物草酸(6.876 min)、缓冲剂柠檬酸(7.685 min)。实验还对比了HPLC法和甲酸脱氢酶法对甲酸定量检测的准确度，HPLC法的相对标准偏差RSD值、线性回归方程确定系数R2值都优于酶偶联法，只是检测耗时较长。

图3 HPLC对草酸脱羧酶催化反应液的分离

2.3 草酸脱羧酶的基本特性

2.3.1 最适pH值和pH稳定性

由图4(A)可知，草酸脱羧酶适宜反应pH偏酸性，最适pH值为3.5。当pH值＞4.5时酶促反应速度随pH下降，pH值6.5时酶活基本丧失。图4(B)表明，酸性条件不利于保持草酸脱羧酶的活性。在弱酸性(pH值4.5～6.5)37℃水浴静置6h后，草酸脱羧酶残余活性达93.5% ～98.7%;但在pH值3.5条件下，酶活仅剩4.1%。实验曾以50 mmol/L的pH值8.0磷酸盐缓冲液在4℃保存草酸脱羧酶30 d，酶活力无显著损失(剩余活性大于97%)。

图4 pH值对草酸脱羧酶活力影响

2.3.2 草酸脱羧酶的最适温度和热稳定性

如图5(A)所示，在pH值4.0时，草酸脱羧酶具有较宽的催化温度范围，但热稳定性较差［图5(B)］。在45～55℃，酶的活性达到最高，相对酶活力超过90%。在37℃温浴保存60 min，酶活仅损失了3.3%;而在50℃，酶活损失随时间延长呈线性上升;60℃下处理10 min，酶活仅剩12.7%，60 min酶活已基本丧失。可见较高温度(50～55℃)虽然加速了酶促反应，但也加速了酶结构的破坏。在应用中采用35～40℃，可获得较高的相对酶活(大于64%)，又可避免酶失活。

图5 温度对草酸脱羧酶活力的影响

2.3.3 金属离子和EDTA对酶活力的影响

在1 mmol/L的浓度下，金属离子和EDTA对草酸脱羧酶活的影响见图6(A)。其中EDTA及Fe2+使酶活力分别提高了9.26%和26.59%;令人感兴趣的是:Mn2+使酶活力降低了54.21%;其他测试离子对草酸脱羧酶活力影响不显著。实验进一步考察了0.1～10 mmol/L浓度Mn2+对草酸脱羧酶的影响(图6B)，结果表明，测试浓度范围内的外加Mn2+对草酸脱羧酶活力的都具抑制作用，低Mn2+浓度下(0.1～0.5 mmol/L)，相对酶活力随Mn2+浓度提高而下降。

图6 金属离子和EDTA对草酸脱羧酶活力影响

2.3.4 动力学常数 Km 及 Vmax的测定

以 1.13、2.26、4.52、5.66、11.31、22.62、45.25、67.87 mmol/L浓度草酸钾为底物，测定对应的酶促反应速度，用Hanes－Woolf作图法(图7)求出草酸脱羧酶的 Km 值为14.53 mmol/L，Vmax为133.33 U/mg。

图7 草酸浓度与酶促反应速度的关系

3 讨论

Mn2+是草酸脱羧酶的组成成分，每个酶亚基分别在N端和C端结构域中各结合1个Mn2+。对草酸脱羧酶催化机理研究表明，活性中心Mn2+的作用直接导致草酸分子 C－C 键的异裂［10，12］。然而，反应体系中添加Mn2+对草酸脱羧酶产生抑制作用，目前未见文献报道。结合添加Mn2+对酶产生抑制，而添加1 mmol/L的EDTA提高酶活力的实验结果，推测草酸脱羧酶分子上除了N端和C端活性结构域可以紧密结合Mn2+外，还有其他部位可以与Mn2+以较弱键的方式结合，这种结合可能改变酶的构象而产生抑制作用;由于在诱导表达过程中使用了浓度为5 mmol/L的Mn2+，其中部分Mn2+以较弱键结合于酶活性结构域以外的部位，当反应液中存在离子螯合剂EDTA时，这部分Mn2+得以从酶分子上清除，从而提高了相对酶活。

实验利用原核表达系统对草酸脱羧酶进行诱导表达，每升发酵液收获草酸脱羧酶活力1 640 U(约12.33 mg酶蛋白)，远高于野生菌的诱导表达量［13］。草酸脱羧反应是消耗质子的过程，一定酸度的反应体系利于脱羧的进行，重组草酸脱羧酶适宜反应pH偏酸性(pH值3.5～4.5)，与丝状真菌来源的草酸脱羧酶相似［14］;但在pH值3.5下酶活力损失严重，应用中选择pH值4.5的反应条件较有利。草酸脱羧酶最适温度在50～55℃，但该温度不利于酶的稳定，在实际应用中采用35～40℃，可获得较高的相对酶活(大于64%)，也避免了高温对酶结构的破坏。草酸脱羧酶在pH值8.0，4℃下可以较长时间保存，其最大酶促反应速度达133.33 U/mg。上述结果可为草酸脱羧酶的应用提供依据。

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Expression and Characterization of Oxalate Decarboxylase

Lin Ri－hui，Xu Li－li，Nong Mian，Zhang Lu－cheng
(Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process，College of Chemistry and Ecological Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China)

Oxalate decarboxylase was expressed and characterized in this paper.After induced by IPTG，820 U/g(wet weight)of oxalate decarboxylase was obtained，and the enzyme was purified 2.07 fold by metal chelate affinity chromatography with a yield of 60.38%.The enzyme had an optimum temperature between 50 and 55 ℃，and optimum pH at 3.5.Addition of EDTA or Fe2+would activate oxalate decarboxylase，but addition of Mn2+would inhibit the enzyme.Under condition of pH4.0，37 ℃，the enzyme’s Kmwas 14.53 mmol/l with Vmax=133.33 U/mg.

oxalate decarboxylase，expression，purification，characterization

草酸脱羧酶(EC 4.1.1.2)催化转化草酸为甲酸和CO2，是植物、微生物中草酸代谢降解的主要催化酶之一［1］。草酸脱羧酶目前已用于医疗检测草酸含量，在食品、工业、农业领域也具有广阔的应用前景。将草酸脱羧酶制成口服制剂可用于减轻控制尿石症［2］;构建含草酸脱羧酶基因的乳酸菌可作为益生菌用于防止高草酸尿症［3］;草酸脱羧酶用于造纸制浆过程可降低流程设备结垢的风险［4－5］;构建含草酸脱羧酶的转基因作物不但可以降低作物草酸含量，改善作物品质，还可提高作物对病原真菌的抗病力［6－7］。

目前，已有关于草酸脱羧酶酶学性质的研究［8－9］。然而，由于菌株来源及检测方法差异，报道的结果差异较大;此外，金属离子对酶的影响都是以诱导表达状态下添加不同离子进行分析［10－11］，金属离子对酶促反应的直接影响未见报道。本研究在原核表达系统对B.subtilis来源的草酸脱羧酶进行诱导表达，利用亲和层析一步纯化，获得纯度较高的重组酶;采用HPLC分析酶活的方法，研究了重组草酸脱羧酶的酶学性质。本研究为深入研究草酸脱羧酶的催化机理，扩大其应用领域提供依据。

1.1 菌种

基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK由本实验室保存。

1.2 培养基

LB培养基组成:1 L培养基含蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，pH7.0。固体培养基添加 18 g琼脂粉。

1.3 试剂

草酸钾、甲酸钠、甲酸脱氢酶，购自Sigma公司;HisTrap HP亲和柱、PD－10脱盐柱为Amersham产品;IPTG、NAD+、胺苄青霉素购自上海生工;其他试剂均为国产分析纯。

1.4 主要仪器及设备

液相色谱仪(日本岛津);凝胶成像系统(美国伯乐);快速蛋白液相色谱系统(美国通用);紫外分光光度计(上海普析)。

1.5 草酸脱羧酶的表达

将基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET32a/YvrK培养至 OD600为0.4时，42℃热冲击 5 min，加人5 mmol/L MnCl2，0.4 mmol/L IPTG，诱导表达 4 h 后，离心收集菌体，以pH8.0磷酸盐缓冲液重悬菌体，超声破碎收集上清为粗酶液。

1.6 草酸脱羧酶的纯化

使用AKTA－FPLC系统进行酶纯化。先以5倍柱床体积 A缓冲液(含20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L的pH8.0磷酸盐缓冲液)平衡柱床。粗酶液过0.2 μm孔径膜后上柱，按以下程序洗脱:含0%的 B缓冲液(含20 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L的 pH8.0磷酸盐缓冲液)冲洗 75 mL，含10%的 B缓冲液冲洗40 mL，B液10%至100%线性梯度洗脱50 mL。洗脱流速为l mL/min。分级酶液利用SDS－PAGE进行分析鉴定。

收集分级酶液经超滤浓缩后，使用PD－10柱脱盐。根据使用说明，先以50 mmol/L的pH8.0磷酸盐缓冲液平衡20 mL，上样2.5 mL，待样品全部进入柱床，加入缓冲液洗脱，收集前3 mL洗脱液即为脱盐的草酸脱羧酶。

博士，副教授(Email:linrihui_0@yahoo.com.cn)。

*广西民族大学重点项目科研基金(200701YJ01)，化工过程创新技术研发平台建设(桂科能0992028－13)资助课题。

2010－10－06，改回日期:2010－12－01