食管癌组织中人乳头瘤病毒16型整合状态的检测

张 科 李淑英 丁广成 赵 莹 刘文博 张云茹

(河北联合大学基础医学院，河北 唐山 063000)

人乳头瘤病毒(HPV)属DNA病毒，与许多部位鳞状上皮细胞良性及恶性肿瘤性病变有关，其中HPV感染与宫颈癌的相关性已得到公认。研究显示，食管癌组织中有HPV基因存在。病毒整合是恶性进展的一个标志，大部分肿瘤含一些整合的HPV拷贝〔1～3〕，HPV整合常引起HPV E2阅读框架(ORF)的断裂或缺失，使E6和E7表达升高，有利于恶性转化。为进一步探讨HPV感染与食管癌发生的相关性，本研究应用实时荧光PCR扩增，检测了食管癌患者组织标本中HPV的整合状态及病毒载量。

1 材料与方法

1.1 材料 河南省林州市食管癌患者手术切除组织标本55例，男21例，女34例，平均年龄为58(46～68)岁。组织切除后立即放入－70℃冰箱保存。293细胞DNA作为内参的阳性对照;含有HPV16E2基因质粒、HPV16 E6-E7质粒及β-actin质粒本室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 本研究中应用实时荧光PCR的原理是依据下列假设：HPV整合时最常缺失的E2开放阅读框(ORF)的特殊区域，如HPV以游离型形式存在，E2与 E6拷贝数比例相等;如HPV整合在宿主染色体中，E2缺失，E2与 E6拷贝数比例为零;如HPV以游离、整合的混合型形式存在，E2的拷贝数少于E6。E2与E6比率代表HPV整合状态。因此，根据GenBank提供的基因序列设计引物，选择HPV16三个E2基因区和一个E6基因区位点设计HPV16E2和E6引物及β-actin引物(如表1)。委托上海生工合成引物。

1.2.2 组织标本中DNA的提取及质量控制 使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，德国)，按说明书指示，食管癌组织标本经液氮冷冻研磨后，提取组织DNA于-－0℃保存。使用β-Actin作内参进行PCR扩增检测所提DNA的质量。PCR中使用了 Ex-Taq(宝生物，大连)，每个反应总体积为25 μl，加入0.5 μl提取的DNA为模板，以293细胞DNA(或β-Actin质粒)为阳性对照。反应条件：95℃预变性5 min，循环参数95℃/1 min，55℃ /1 min，72℃ /1 min，5 个循环;95℃ /20 s，55℃ /30 s，72℃ /30 s，40个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。

表1 实时荧光PCR的引物序列及大小

1.2.3 荧光定量PCR检测组织标本中HPV16、病毒载量及整合状态 用上述表1的引物。EvaGreen荧光染料，在Rotor Gene荧光PCR系统进行PCR扩增，用每套引物将六个梯度的质粒和每一例待检样品平行分析三次。首先，用HPV16E6型特异性引物检测HPV16;第二，β-actin引物检测其含量;第三，用HPV16E2引物进行检测。PCR反应体系(25 μl)：1×Ampli-Taq Gold Buffer(MgCl2free)，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L 混合 dNTPs，2 pmol/L 引物，1.25 μl 20 × EvaGreen，0.25 μl Rx，5 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶，加入0.5 μl癌组织标本DNA作为模板，加双蒸水至25 μl，进行荧光定量PCR扩增。反应中，用双蒸水作为阴性对照，用六个稀释梯度的质粒作为阳性对照。病毒载量(copies/cell)由下列公式计算：(E6copy/β-actincopy)×2，其结果为每个细胞中HPV16的拷贝数;整合状态由E2与E6的拷贝数的比值决定。

2结果

2.1 实时荧光PCR进行HPV16、病毒载量及整合状态分析

依据标准曲线得到每一待检标本的β-actin、E2、E6基因的拷贝数。每1例标本用每对引物平行分析三次，取三次平行分析结果的平均值，结果55例标本中检测到32例标本阳性，其阳性率为58.2%;每例样品所含有HPV16的病毒载量为0.066～65.2拷贝(如表2)。

表2 32例HPV16阳性样品中的病毒载量及HPV16的整合状态

2.2 标本DNA的提取和质量控制 依据所提取标本DNA的电泳条带，说明DNA浓度比较均一如图1A。以293细胞DNA为模板的阳性对照，其PCR产物为290 bp，55例标本DNA经内参β-actin扩增后得到与阳性对照相一致的电泳条带，如图1B。说明所提标本DNA都能满足进一步的实验要求。

依据E2与 E6的比值，确定HPV16的整合状态。32例HPV16阳性标本中，检测到有2例(6.3%)标本E2基因没被破坏，E2与E6的比值大于一，HPV16呈游离状态;3例没有检测到E2基因，9.4% 是完全整合状态，E2与E6的比值等于零;27例检测到E2与E6的比值大于零而小于一，84.4% 既有整合又有游离的病毒存在;并且在游离与整合的混合型中，有21例整合型多于游离型(表2)。提示32例HPV16阳性食管癌样品中，病毒DNA与宿主基因整合很普遍。

图1 食管癌样品中DNA质量检测

3讨论

实时荧光定量PCR技术检测病毒存在状态的原理：HPV整合时，E2中心区域“绞链区”因其不稳定性而成为HPV整合入宿主细胞最常见的HPV缺失或断裂部位，而E6和E7 ORF及长控区(LCR)常保持完整〔4〕。因此，在设计引物时，选择HPV16 E2区的三个不同部位设计引物，即HPV16 E2起始区2 755～2 942，“绞链区”3 355～3 526，接近终点区3 602～3 786区设计引物，这样设计的引物可真实地反映HPV16的缺失或断裂部位，从而可真实地反映整合状态。根据这一原理，如HPV以游离型形式存在，E2与E6拷贝数比例相等;如HPV整合型在宿主染色体中，E2缺失，E2与 E6拷贝数比例为零;如HPV以游离和整合的混合型形式存在，E2的拷贝数少于E6。E2与E6比率代表HPV整合状态。因此，可通过E2/E6比值观察HPV基因组在宿主染色体上的整合情况。在本项研究中，为使E2与E6的比率准确的反映HPV的整合状态，我们在设计E2的引物时，分别选择了三个不同的区域，即E2基因的两端和中心区域。

我们用含有看家基因β-actin、HPV16 E2全长及E6～E7的质粒为标准品，进行β-actin、HPV E2及E6基因的定量。结果显示，三条标准曲线相关系数均大于0.95，表明标准曲线相关性好，符合标准曲线定量法的要求。因而，我们能够对HPV16 E2和E6基因进行准确的定量。

通过实时荧光PCR检测人看家基因β-actin含量，及每例样品中E6含量，可估测出HPV的病毒载量(包括游离和整合)。通过计算每例标本HPV16E6的拷贝数与β-actin的拷贝数之比，计算得到HPV16的拷贝数。32例样品中，大约每个细胞含有0.066～65.2拷贝数。这一范围的病毒载量与宫颈上皮内瘤变病毒载量(每个细胞大于8 000拷贝)〔5〕相比，显然是很低的，因而需用较灵敏的方法才能检测到。

虽然在宫颈上皮瘤变中，瘤变的进程与HPV整合到宿主染色体的病毒载量相关〔6〕，但在一些HPV阳性的宫颈癌细胞系中，有较低的病毒载量，如SiHa细胞系中，每个细胞中HPV16的拷贝数为1～2拷贝〔7〕，HeLa细胞系中，每个细胞中HPV18的拷贝数为10～50拷贝〔8〕。结合我们研究的结果，推测在一些食管癌中虽然病毒载量较低，但当病毒与宿主基因组整合后，改变了其他基因的结构与功能，低病毒载量仍可导致或促进肿瘤的发生。

本研究提示在食管癌组织中，HPV16大多以游离和整合的混合形式存在，但整合型所占比例多于游离型。Si等〔8〕用荧光PCR方法研究了35例HPV16阳性标本的整合状态，其结果表明，2例为完全整合、3例为完全游离、30例为游离和整合同时存在。提示在食管癌组织标本中HPV DNA与宿主细胞基因的整合很普遍。这些结果进一步说明，HPV感染可能是食管癌发生的重要危险因子，食管癌发生与HPV感染有关。

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3 Wilke CM，Hall BK，Hoge A，et al.FRA3B extends over a broad region and contains a spontaneous HPV16 integration site：direct evidence for the coincidence of viral integration sites and fragile sites〔J〕.Hum Mol Genet，1996;5(2)：187-95.

4 Badaracco G，Venuti A，Sedati A，et al.HPV-16 and HPV-18 in genital tumors：significantly different levels of viral integration and correlation to tumor invasiveness〔J〕.J Med Virol，2002;67(4)：574-82.

5 Swan DC，Tucker RA，Tortolero-Luna G，et al.Human papillomavirus(HPV)DNA copy number is dependent on grade of cervical disease and HPV type〔J〕.J Clin Microbiol，1999;37(4)：1030-4.

6 Peitsaro P，Johansson B，Syrjanen S.Human papillomavirus type 16 is frequently found in cervical cancer precursors as demonstrated by a novel quantitative real-time PCR technique〔J〕.J Clin Microbiol，2002;40(3)：886-91.

7 Hugo AP，Peyton CL，Joste NE，et al.Human papillomavirus type 16 integration in cervical cancer〔J〕.JCM，2006;44(5)：1755-62.

8 Si HX，Tsao SW，Poon CSP，et al.Physical status of HPV16 in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Clin Virol，2005;32(1)：19-23.