HPV16 E6和E7对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及其机制*

李 娜，冶亚平，朱会芳，韩芳毅，千新来

(新乡医学院病理学教研室,河南新乡 453003)

乳头瘤病毒(human papillomaviruses，HPVs)是一组小分子双链DNA病毒，研究证实高危型人乳头瘤病毒(high risk-HPVs，hr-HPVs)特别是HPV16型与宫颈癌的发生、发展存在着密切关系，其与肺癌和乳腺癌等恶性肿瘤的发生与演进的关系也受到广泛关注[1-2]。本研究以人低转移乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，通过脂质体将HPV16 E6、E7和同时表达E6/E7的重组质粒转入MCF-7细胞，探讨HPV16 E6、E7和E6/E7同时稳定表达对HPV16阴性的乳腺癌细胞侵袭能力的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 (1)质粒与细胞株：pcDNA3.1-E6、pcDNA3.1-E7和pcDNA3.1-E6/E7真核表达质粒由本实验室构建并保存。人低转移乳腺癌细胞系MCF-7购于中科院上海细胞库。(2)主要试剂：SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒、lipofectamineTM2000均为Invitrogen公司产品。羊抗HPV16 E6多克隆抗体(IgG)、鼠抗HPV16 E7单克隆抗体(IgG)为美国Santa Cruz公司产品。引物由上海生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养与基因转染 细胞在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的完全培养基中37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞长至70%融合时，按lipofectamineTM2000说明书进行转染，转染9 h后，更换新鲜完全培养基，培养48 h，设置MCF-7-vect转染组、MCF-7亲本细胞组、转基因组(MCF-7-E6细胞组，MCF-7-E7细胞组，MCF-7-E6/E7细胞组)。用G418(800 μg/mL)筛选阳性克隆。每种转染细胞分别挑取4个单克隆培养扩增，获得稳定转染细胞。

1.2.2Western blot检测蛋白表达 按照试剂盒说明书提取细胞质、细胞核蛋白，蛋白上清经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(5%浓缩胶，12%分离胶)后转移至硝酸纤维素膜，TBST封闭，一抗室温摇育，TBST洗涤；二抗于室温摇育，TBST洗涤，膜与化学发光底物孵育3～5 min，经X线片曝光、显影、定影。显色结果用软件Bandscan5.0进行灰度分析，并计算蛋白的相对表达水平。……