MTHFR基因A1298C多态性与大肠癌易感性的关系

孙全昌，刘荣霞，郑纪宁

(承德医学院，河北承德 067000)

大肠癌是人类主要恶性肿瘤之一，近年来在我国，特别是大城市其发病率有上升趋势。有研究显示，叶酸摄入过低或合成减少是大肠癌的危险因素之一[1]。而亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，是叶酸代谢的限速酶，能不可逆的催化5,10-亚甲基四氢叶酸向5-甲基四氢叶酸转化，后者作为甲基供体经蛋氨酸合成酶的催化，使同型半胱氨酸转化为蛋氨酸，蛋氨酸作为甲基供体参与DNA甲基化。因此，MTHFR基因多态可能通过影响DNA的甲基化水平或影响DNA合成，改变不同基因型个体癌症的易感性。目前关于A1298C位点多态与大肠癌易感性的研究较少，且研究结果存在较大差异[2]。本文选择河北省承德市作为研究地点，探讨MTHFR基因A1298C多态与大肠癌易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2010年7月至2011年6月就诊于承德医学院附属医院肿瘤科的大肠癌(CRC）患者120例，所有病例均经临床资料和组织病理学检查确诊。其中，男64例、女56例，年龄28-80岁，平均62岁。

1.2 主要试剂 TIANamp Genomic DNA提取试剂盒，天根生物技术有限公司;2xTaq MasterMix、DNA Marker、引物(上游引物5’-CTTTGGGGAGCTGAAGG ACTACTAC-3’，下游引物5’-CACTTTGTGACCATT CCGGTTTG-3’），上海生工生物工程有限公司;内切酶MboⅡ，Fermentas公司。

1.3 方法

1.3.1 提取DNA:采集研究对象外周静脉血2ml，采集管EDTA抗凝，按试剂盒说明提取外周血总基因组DNA，-20℃保存。

1.3.2 PCR扩增:MTHFR基因A1298C多态位点检测采用PCR-RFLP方法。反应体系20μl，含上、下游引物(10μmol/L）各1.0μl，2xTaq MasterMix(内含Taq DNA、PCR Buffer、MgCl2和dNTP）10μl，DNA 溶液2μl，ddH2O 0.6μl。反应条件94℃预变性2min，94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共34 个循环，72℃延伸2min。

1.3.3 MboⅡ酶切:酶切总体系31.5μl，其中PCR扩增产物10μl，Buffer 2μl，Mbo Ⅱ 1.5μl，双蒸水18μl。轻轻混匀并短暂离心，37℃消化3h，65℃ 20min灭活MboⅡ。1.3.4 多态性分析:取酶切产物10μl，3%琼脂糖凝胶电泳确定基因型，包括野生型纯合子A/A(56bp)、杂合子A/C(56/84bp)和变异型纯合子C/C(84bp)三种。……