液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A

顾亮，丁磊

（安徽国家农业标准化与监测中心，合肥 230051）

液相色谱串联质谱法测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A

顾亮，丁磊

（安徽国家农业标准化与监测中心，合肥 230051）

利用液相色谱串联质谱（LC-ESI-MS/MS）测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A。通过一系列实验对样品前处理条件进行了优化，样品经乙腈提取、乙酸酸化、净化后，采用HPLC-ESI-MS/MS检测分析，在多反应监测模式（MRM）下，外标法定量。方法的检出限为0.05 mg/kg，各组分浓度在0.001～0.2 mg/kg范围内与定量离子峰面积呈良好的线性关系（r＞0.99）。平均加标回收率为61%～75%，测定结果的相对标准偏差为2.78%～4.37%(n=6)。该方法简便、准确，各项技术指标均满足国内外有关饲料中瘦肉精检测要求，可用于饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和苯乙醇胺A残留的分析测定。

盐酸克伦特罗；莱克多巴胺；沙丁胺醇；苯乙醇胺A；高效液相色谱-串联质谱；饲料

β-受体激动剂属于苯乙胺类药物，能减缓或减少脂肪沉积，增加肌肉蛋白沉积，使营养重新分配，从而显著提高动物酮体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率。因此，β-受体激动剂被大量非法用于畜牧生产，其中最常用的有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等。长期食用含有β-受体激动剂残留的食品将对人体健康产生极大的危害,可诱发和加重心率失常病人的病情，引起心室早搏，四肢、脸、颈部骨骼肌震颤;另外还能引起代谢紊乱，对糖尿病人可发生酸中毒或酮中毒。

近年来，一些新型的β-受体激动剂药物被发现用于畜牧生产中，例如苯乙醇胺A等，为了保护人们的身体健康，必须从各个环节上确保畜产品的安全。开展饲料及饲料添加剂中克伦特罗和莱克多巴胺等β-兴奋剂的检测是从源头进行控制的有效手段。因此研究饲料中克伦特罗和莱克多巴胺等β-兴奋剂含量的检测方法具有重要的意义。中国卫生部、农业部、国家药品监督管理局发布的第176号公告（2002）和第1519号公告（2010）《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A，国际上大多数国家规定禁用这些β-兴奋剂类物质。

目前检测饲料中β-兴奋剂类物质的方法主要为高效液相色谱串联质谱法，检测物质多为盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，同时检测饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A尚未见报道，因此笔者对利用液相色谱串联质谱（LC-ESI-MS/MS）同时测定饲料中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A进行了研究。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪：6410Triple Quad LC/MS型，美国安捷伦公司；

离心机：Z-323 K型,德国HERMLE 公司；

氮吹仪：N-EVAP 12型，美国Organomation公司；

超声波清洗器：KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

混匀器：MS 3basic型，德国IKA公司；

去离子水发生器：M illi-Q型，美国M illipore公司；

甲醇、乙腈、乙酸、甲酸：色谱纯，美国Tedia公司；

实验用水：M illi-Q去离子高纯水；

有机微孔过滤膜：孔径0.22 μm；

聚丙烯离心管：50m L；

盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A标准品：德国Dr. E公司。

1.2 仪器分析条件

（1）液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱（50mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：35℃；流速：0.30m L/m in ；进样量：10μL ；流动相：0.1% 甲酸水溶液（A），乙腈（B），梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相及梯度洗脱条件

（2）质谱分析条件

离子源：电喷雾离子源（ESI+）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：350℃；干燥气流速：11 L/m in；雾化器压力：289.6 kPa（42 Psi）；毛细管电压：4 000V ；对于所有的目标化合物，其最佳的碰撞电压以及相应的定性离子对、定量离子对见表2。

表2 多反应监测（MRM）条件

在上述液相色谱、质谱条件下，4种β-兴奋剂类物质总离子色谱图见图1。

图1 4种β-兴奋剂类物质总离子色谱图

1.3 样品前处理

（1）提取

称取5 g粉碎试样（精确至0.01 g）于50m L具塞塑料离心管中，加入10m L含5%甲酸的水-乙腈混合溶液（体积比1∶2），室温下水浴超声20m in后，以10000r/m in离心10m in，取上清液，备用。

（2）净化

固相萃取柱（PCX）先用3 m L甲醇、3 m L水活化，将上清液过柱，依次用3 m L水、3 m L甲醇淋洗，抽干5 m in，用5%氨水甲醇溶液5 m L洗脱，收集洗脱液于50℃水浴中用氮气缓慢吹干后用流动相定容至 1.0m L，过 0.22 μm 微孔滤膜，供仪器检测。

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件优化

目前动物源性食品中的β-兴奋剂类物质残留检测的提取液多为2.0mol/L的乙酸铵缓冲溶液（pH 5.2）、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，且需要37℃恒温水浴过夜，上述方法不适用于饲料中β-兴奋剂类物质的检测，因为饲料中的β-兴奋剂类物质多为非法添加，不像动物源性食品中残留的β-兴奋剂类物质已经同动物体内的蛋白质发生轭合反应和蛋白质结合等作用。因此在选择样品提取溶液时没有考虑上述提取溶剂，在参考其它文献的基础上选择了5%甲酸水-乙腈作为提取溶剂，通过优化两者之间的体积比例获得最高回收率，实验最终选择5%甲酸水－乙腈（体积比1∶2）作为提取溶剂。

2.2 净化条件的优化

根据β-受体激动剂苯环上取代基的差异，可分为苯胺型和苯酚型。克伦特罗属于苯胺型结构，轭合反应率和蛋白结合率低，其余为苯酚型。由于兽药残留基质的复杂性，在检测前一般需对提取液进行净化。常见的净化技术主要是液-液分配和固相萃取，其中液-液分配对苯胺型净化效果较好，但由于苯酚型极性相对较高，回收率低，因此实验采用混合型固相萃取柱PCX－固相萃取净化样品。

2.3 仪器条件的选择

在LC-MS/MS分析中，色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的，为了使每个组分都能得到分离和鉴定，以获得最大的灵敏度，必须设置合适的色质分析条件，特别是质谱条件。

色谱条件包括色谱柱类型、流动相组成、流动相大小、柱温等。质谱条件包括离子源、离子化模式、离子源温度、雾化气流量、质量扫描范围、定量检测模式等，这些都要根据样品情况进行设定。通过试验优化的仪器分析条件见表1、表2。

2.4 工作曲线方程与检出限

在优化条件下，配制一系列不同浓度的混合标准溶液进行测定，以各组分定量离子的峰面积对浓度绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表3。结果表明，在 0.001～0.2 mg/kg 范围内，4 种 β-兴奋剂类物质的质量浓度（X）与定量离子的峰面积（Y）呈良好的线性关系。对不含瘦肉精的空白样品进行测定，以10倍信噪比计算方法的检出限为0.05mg/kg。

2.5 精密度和回收试验

采用在空白样品中添加标准溶液的方法，分别

表3 工作曲线方程、线性范围、相关系数、检出限

对不同饲料样品中4种β-兴奋剂类物质进行5个水平的添加回收试验，每个水平进行6次重复试验，试验结果见表4。由表4可知，回收率为61%～75%，6次测定结果的相对标准偏差为2.78%～4.37%。

表4 回收试验结果(n=6)

3 结语

建立了液相色谱串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）法，并快速、准确地测定了饲料中4种β-兴奋剂类物质残留量。该方法具有快速、灵敏、准确和操作简单的特点，能够很好地应用于各种饲料中β-兴奋剂类物质的分析检测。

［1］Yang Y T，Ecellgo tt M a.M u ltip le action o f ad renergic agonistsonskeletal muscle and adipose tissue[J]. Biochem istry，2000，261:1-10.

［2］Li Junsuo，Qiu Yuem ing，Wang Chao. Residue analysis for veterinary drug[M].Shanghai：Shanghai Scientific & Technical Publishers，2002:641-658.

［3］高燕红，吴西梅.液质联用快速测定饲料中的莱克多巴胺和克伦特罗 [J].中国卫生检验杂志，2005，15 (6):643-645.

Determ ination of Clenbuterol Ractopam ine Salbuterol and Nylethanolam ine in Feeds by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem M ass Spectrometry

Gu Liang，Ding Lei
（National Center of Agricultural Standarlization and Supersion，Hefei 230051，China）

A new method was developed for the determ ination of clenbuterol, ractopam ine, salbuterol and phenylethanolam ine A by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry.Sample preparation and HPLC-MS/MS analytical conditions were examined and optimized critically by use of a series of experiments study. Samples were extracted by acetonitrile，then cleaned up，and analyzed qualitatively and quantitatively by LC-ESI-MS/MS. The method detection lim it （LOD）was 0.05 mg/kg. Element concentration was linear w ith peak area in the range of 0.001-0.2 mg/kg（r ＞ 0.99）. The average recoveries ranged from 61% to 75%. The method is simple，effi cient，accurate and can meet the requirements of determination for clenbuterol，ractopamine，salbuterol and phenylethanolamine A in feeds.

clenbuterol; ractopam ine; salbuterol; phenylethanolam ine A; liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry; feed

O657.99

A

1008-6145(2012)01-0037-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2012.01.011

联系人：丁磊；E-mail:dinglei8@126.com

2011-10-12