Tn5及其应用研究进展

徐广宇，魏成国，马金姝，张晓天，王 放＊

（1.吉林大学白求恩医学院 病原生物学教研室，吉林 长春 130021；2.北华大学药学院，吉林 吉林 132013）

转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置［1］。Barbara Mc－Clintock［2，3］根据大量遗传学和细胞学研究结果，于1951年提出了生物的基因组中存在转座子学说，这是遗传学发展史中划时代的重大发现，将基因概念向前推进了一大步。近年来，随着现代分子生物学技术的发展及基因功能研究的不断深入，转座子技术的应用越来越广泛。Transposon 5（Tn5）由于其转座的随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点，得到越来越多的应用，已经成为分子遗传学及基因诊断学研究的热门工具［4，5］。本文主要对Tn5的基本结构、转座机制及其在必需基因、蛋白质结构功能、基因测序方面的应用研究进展作一综述。

1 Tn5简介

1.1 Tn5的基本结构

Tn5是复合转座子，由一个中心区域和二个侧翼序列组成。中心区域含有3个抗生素抗性基因，包括卡那霉素（kanamycin）、链霉素（streptomycin）和博莱霉素（bleomycin），中心区域的两侧的侧翼序列IS是一种自主性的转座因子。位于Tn5右侧的IS50R编码含有476个氨基酸的转座酶（transposase，tnp）和一个转座阻遏蛋白（inhibitor protein，Inh），这两种蛋白质都由同一段DNA序列编码；Tn5左侧的IS50L与右侧的IS50R只是一对碱基的差别，IS50L上存在一个突变序列，可以使翻译提前终止，不能产生有活性的转座酶和转座阻遏蛋白［6］。每个IS50转座元件的两端有长度19 bp的outside end（OE）和inside end（IE）末端序列，OE是转座酶的结合位点（图1）。

1.2 Tn5的转座机制

1.2.1 Tn5的转座过程 Tn5的转座属于非复制型转座。在转座过程中，Tn5转座酶单体先绑定到Tn5末端OE上的结合位点，并且连接供体DNA形成复合体；形成联会复合体后，在某种条件下（热刺激或者阳离子存在）Tn5转座酶具有切割DNA的活性，使Tn5从复合物中释放；离开复合体后Tn5随机插入到目的DNA上，插入位点的9 bp序列的两条链会分开，并分别连接在Tn5的两端形成粘性末端（图2）；最后在DNA聚合酶的作用下补平缺口，转座子的两端形成9 bp 的正向重复序列［6，7］。

图1 Tn5的基本结构

图2 Tn5插入位点的复制

1.2.2 Tn5转座位点的确认 Tn5转座元件IS50的末端有一段长19bp的序列，我们跟据此序列设计特定引物，然后使用反向PCR法对Tn5插入位点的DNA序列进行扩增（图3），测序后通过BLAST系统就可以得到Tn5插入基因的序列［8］。

图3 Tn5插入位点的确定

2 Tn5的应用研究进展

2.1 Tn5在必需基因方面的研究进展

维持某种生物细胞生长所必需的基因被称为是这个生物的必需基因［9］。转座子可以对基因进行调控，是因为转座子插入后会引起插入位点所在基因失活。如果插入的基因是必需基因，则该细菌死亡，不能生成菌落；如果插入的是非必需基因，则可能影响该基因的表达，但不影响该细菌的生长，生成菌落，因此我们可以通过转座子筛选出非必需基因。

由于Tn5的转座随机性更高，稳定性更好，并且插入位点更容易确认，因而发现必需基因的几率更高，更准确。S.Y.Gerdes［10］等通过Tn5构建的遗传印记技术，发现大肠杆菌MG1655的遗传物质中存在大量转座进化形成的REP序列，在4291个蛋白编码基因中，筛选出3746个基因，其中包括620个必需基因和3126个非必需基因。Byung Jo Yu和Sun Chang Kim［11］等在大肠杆菌中通过Tn5构建的Cre／loxP重组系统，利用Tn5高效随机插入和卡那霉素抗性基因产生的突变菌库，筛选出大量的非必需基因，进而找到筛选必需基因的可行性。Severine［12］等在猪布鲁士菌中使用Tn5建立相关鼠科模型，通过研究发现norD基因不仅编码与猪布鲁士菌毒性密切相关的一氧化氮还原酶，而且也是猪布鲁士菌的必需基因。

我们可以通过Tn5对一些病原体必需基因的研究，开发潜在的药物作用靶点，更加有效地治疗疾病［13，14］。肺炎克雷伯菌是一个众所周知的条件致病菌，在呼吸道感染的早期阶段可能与其生物膜的形成有关，Heather F［15］等通过mini－Tn5突变体库的构建，研究了在体外生物膜形成和体内肺炎克雷伯菌感染之间的关系，并且找到相关的基因；Stahlhut SG［16，17］等通过Tn5产生的随机突变，分离肺炎克雷伯菌临床株C3091的生物膜基因并构建克隆质粒在大肠杆菌中表达，共筛选出1152个能增强生物膜特性的克隆体，其中9个克隆体能显著增强生物膜的特性，5个克隆体包含众所周知的与肺炎克雷伯菌毒力因子和生物膜相关的类型3鞭毛基因。

我们还可以通过对某些病原体必需基因的鉴定，而使其成为诊断该疾病的标准。Sakamoto H［18］等在原核病原生物疟原虫的研究中发现，很多转座子在疟原虫中转座效率很低，而从大肠杆菌中分离并重新构建的Tn5的衍生物mini－Tn5具有很高的转座效率，因此通过构建mini－Tn5转座穿梭突变，建立了通过必需基因诊断疟原虫病的方法。

2.2 Tn5在蛋白质方面的研究进展

近年来，随着分子生物学及转座子技术的广泛应用，转座子逐渐成为蛋白质功能研究的重要工具。通过转座子的随机插入，可以找到相关功能的开放阅读框架，进而影响相关的基因表达，即对蛋白质功能进行研究［19］。

Tn5在蛋白质结构功能方面的研究主要体现在通过Tn5的高效随机插入，由Tn5上携带的已知基因和未知目的基因产生融合蛋白，因为随机插入的目的基因不同，产生的融合蛋白也不相同，通过对不同融合蛋白的研究就能发现相关的目的基因以及相应的转座子系统。兔热病杆菌是一种能感染人类淋巴系统的病原体，为了对这个病原体进行遗传分析，Blake W.［20］等建立了一个温度敏感的以Tn5为基础的转座子系统，通过活跃的转座酶的催化作用，找到能够产生与LacZ基因或luxCDABE基因相关的染色体报告融合蛋白，并能够监测基因表达的能力，从而建立了兔热病杆菌毒力相关基因的一个新的转座子系统。James A.［21］等通过Tn5构建了的辅助基因转座子插入技术（Transposon Assis ted Gene Insertion Technology，TAGIT），通过辅助基因转座子插入技术把绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）随机插入到染色体位点上，但不破坏其操纵子结构，然后对绿色荧光蛋白进行追踪分析，最终有可以得到有用的部分功能的靶蛋白。

Tn5在蛋白质功能方面研究的应用还通过其衍生物Tnpho A进行［22，23］。当 Tn－pho A 随机插入目 的 DNA 时，有缺陷的pho A的羧基端肽段可能融合到目的蛋白的氨基端肽段上，并在目的基因和pho A之间产生正确的阅读框架，结果可产生融合蛋白。Tn－pho A在研究蛋白方面有许多应用：1.检测蛋白的表达并定位蛋白；2.通过随机插入目的DNA，找到新的编码跨膜蛋白或细胞周间质蛋白的基因。在研究原核生物病原体特定输出信号中，Matthew［24］等通过构建mini－Tn5 pho A方法在输出蛋白和pho A基因中产生融合蛋白，以此来分离特殊输出信号，并且由实验验证表明，结核分支杆菌4种分泌蛋白能够携带敏感信号Tat，因此表明Tat是重要的与人类疾病相关的致病因素。

2.3 Tn5在基因测序的应用

基因测序，即测定DNA序列。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和Gilbert（1977）发明的化学降解法。这两种方法不仅测序的时间长，而且过程繁琐。1994年Sootte等利用构建人工转座子，在原有测序技术的基础上发展了一种快速简便的DNA的测序方法。Tn5在基因测序方面的应用是最近的研究热点，Tn5的插入是一个随机性很高的过程，当Tn5转座后，先利用携带的抗性基因进行阳性筛选，然后使用转座子两端的特异序列构建引物，通过引物对阳性克隆进行PCR扩增，然后进行测序，最后通过计算机对扩增的序列进行分析，进而得到完整的序列信息。用Tn5转座子进行测序不仅快速，而且准确。

一般转座子对目标DNA插入是有一定位点的选择性，但Tn5对于目标DNA的插入选择基本完全随机，因此其在基因测序方面的应用非常广泛。Tn5转座子用于测序有以下几个优点：（1）形成大量的转座突变体，可以同时测序，使测序更快捷便利；（2）可以在Tn5上加入一些修饰基因，使测序更方便。

3 展望

随着遗传学及分子生物学的不断发展，转座子技术的应用也越来越广泛。Tn5由于其随机性好，转座后稳定，转座频率高，易于筛选等一系列优点，成为了研究基因、蛋白质功能和测序的有效工具，并且在疾病诊断、基因治疗、免疫功能研究等方面显示了良好的前景。但Tn5也有一些不足，如虽然Tn5的转座随机性很高，但仍有一些热点冷点存在；Tn5转座酶活性的高低影响了Tn5的转座效率等。此外，Tn5在微生物、植物、动物乃至人类的基因功能研究中都发挥着重要的作用，随着研究的深入，Tn5的应用也会更广泛，人们对基因功能的认识也将会更加全面。

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