来自链霉菌属的阿魏酸酯酶的分离纯化、理化性质

范韵敏

来自链霉菌属的阿魏酸酯酶的分离纯化、理化性质

范韵敏

（漳州职业技术学院, 福建 漳州 363000）

通过盐析透析、离子层析、疏水层析，对链霉菌属发酵液中的阿魏酸酯酶（FAE）进行分离纯化，并进行酶学性质研究。得出的阿魏酸酯酶的纯化倍数为2.67，回收率为55.8%，酶分子约为30 kDa。其最适反应pH约为6.0，最适温度约为50°C，金属离子Cu2+和Zn2+对阿魏酸酯酶酶活力均有明显的抑制作用，而Mg2+、Fe2+、Ca2+、Na+和Mn2+对酶的活性均有一定的促进作用。

阿魏酸酯酶；纯化；性质

阿魏酸酯酶[1]（E.C.3.1.1.73，Ferulie acid esterases，FAE），属于羧酸酯酶类，是一种典型的肉桂酸酯酶。它可破坏阿魏酸与多糖相连的酯键，从植物细胞壁中释放阿魏酸，让余下的多糖主链易被降解，有效提高了含有大量木质纤维素和阿魏酸的副产品的营养价值[2]。阿魏酸酯酶的活性是在橄榄产色链霉菌和裂褐菌的发酵液中第一次被发现[3]。此后，几种微生物被证实能分泌阿魏酸酯酶，以真菌为多，细菌与放线菌较少。但不同微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、理化性质和催化功能上有所不同[4,5]。

研究对一链霉菌属发酵的阿魏酸酯酶的分离纯化，考察了其最适反应pH、最适温度，以及金属离子对其的影响，为木质纤维综合利用提供了前期的研究参考。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要试剂和仪器

反式阿魏酸标准品，EDTA，阿魏酸甲酯(MFA)，硫酸铵，过硫酸铵，低分子量SDS蛋白Marker，考马斯亮蓝，DEAE-Sepharose Fast Flow层析介质，Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow层析介质， AKTA Prime蛋白质纯化仪，蛋白电泳仪， Agilent 1100高效液相色谱仪，Thermo EC120小型垂直电泳系统，ODS-C18色谱柱(5μm，4.6 mm×250 mm)，Gis-2008凝胶成像系统。

1.1.2菌种：从土壤中筛选得到的链霉菌属

1.2培养基及培养条件

（1）斜面培养基：高氏一号培养基，pH 7.2-7.4，28°C培养72 h。

（2）液体种子培养基：高氏一号培养基，不加琼脂，pH自然。培养条件：250 mL三角瓶内装50 mL液体培养基，28°C，200 rpm培养72 h。

（3）发酵培养基（%）[6]：KH2PO40.30、Na2HPO4·7H2O 0.60、NaCl 0.01、酵母粉0.80、麦糟1.33（粒径<0.054mm）。培养条件：250 mL三角瓶内装75 mL发酵培养基，28°C，210 rpm培养68 h。

1.3阿魏酸和阿魏酸酯酶酶活测定

1.3.1阿魏酸的测定

采用HPLC法[7]。流动相为甲醇：水：冰醋酸=30 : 69.5 : 0.5(v:v:v)；流速为0.8 mL/min；柱温30°C；检测波长318 nm；ODS-C18柱；进样量为20 μL；检测器为紫外检测器，进行等梯度洗脱。

1.3.2阿魏酸酯酶酶活测定[8]

发酵液离心后取250 μL上清液加入250 μL阿魏酸甲酯溶液，50°C保温15 min后加500 μL的冰乙酸（10% v/v），离心，4°C保存。空白样品为煮沸失活的发酵上清液，处理方法同上。用HPLC法测定其阿魏酸含量。根据公式：酶活力（U/mL）=W×Df×1000 / 194.18×15×0.25，从而算出阿魏酸酯酶酶活力。式中，W：酶解反应产生的阿魏酸量（mg）；Df：稀释度；1000：将mmol转化成µmol所乘的系数；194.18：阿魏酸的分子量（mg/mmol）；15：反应时间（min）；0.25：与底物反应的待测酶液量。

1.4蛋白质标准曲线的绘制

蛋白质标准曲线的绘制采用考马斯亮蓝法[9]。

1.5盐析曲线的绘制

根据硫酸铵饱和度，称取相应重量的固体硫酸铵，加入发酵上清液，使其饱和度分别为40%、45%……95%、100%，4°C静置24 h后离心，弃上清，加10 mL pH 6.0，Na2HPO4-C6H8O7缓冲液。分别测定各个硫酸铵饱和度的沉淀的酶活力。将未经硫酸铵处理过的原始酶液的总酶活定为100%。沉淀的酶活力与总酶活的比值定义为相对酶活，绘制盐析曲线图。确定最佳硫酸铵饱和度。

1.6 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析原理

平衡缓冲液：pH 6.0，0 M NaCl，Na2HPO4-C6H8O7缓冲液。洗脱缓冲液：pH 6.0，1 M NaCl，Na2HPO4-C6H8O7缓冲液。用平衡缓冲液平衡DEAE-Sepharose Fast Flow柱，流速为5 mL/min。上样量为2 mL。后用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱流速为5 mL/min，采用部分收集器连续收集洗脱液，用于测定酶活，以确定最适的洗脱梯度。

1.7 Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析

平衡缓冲液：pH 6.0，40% 的饱和(NH4)2SO4，Na2HPO4-C6H8O7缓冲液。洗脱缓冲液：pH 6.0，Na2HPO4-C6H8O7缓冲液。用平衡缓冲液平衡Phenyl FF柱后上样，流速为1 mL/min。上样量为2 mL。后用洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱流速为1 mL/min。采用部分收集器连续收集洗脱液，用于酶活测定。以确定最适的洗脱梯度。

1.8 SDS-PAGE 蛋白电泳

本实验用10%分离胶及5%浓缩胶制胶。样品加等体积的2×上样缓冲液，沸水浴5 min，瞬时离心。上样量为10-15 μL，采用15 V/cm的电压进行电泳，采用考马斯亮蓝进行染色1-2 h，SDS聚丙烯酰胺凝胶进行脱色3 h以上，后用GIS-2008凝胶成像系统观察并拍照。

1.9阿魏酸酯酶酶学性质研究

1.9.1最适反应pH值和pH值稳定性的测定

最适反应pH值的测定：在50°C，不同的pH值条件下分别测定酶活，以酶活最高为100%，计算相对酶活。所用缓冲液是0.2 M，pH 4.0-9.0的Na2HPO4-C6H8O7缓冲液。

pH值稳定性的测定：将酶液置于不同pH值的0.2 M，pH 4.0-9.0的Na2HPO4-C6H8O7缓冲液中，在50°C保温，测定残留酶活性，以各pH值的初始酶活为100%，计算百分比。

1.9.2最适反应温度和温度稳定性的测定

最适反应温度的测定：在酶液中加入等体积的MFA，在25°C -60°C范围内，随时间变化每隔5°C，测定酶活。以该温度初始酶活为100%，计算相对酶活。所用缓冲液是0.2 M，pH 4.0-9.0的Na2HPO4-C6H8O7缓冲液。

温度稳定性的测定：在0.2 M，pH 6.0的Na2HPO4-C6H8O7缓冲溶液中，分别将酶液置于 25°C、30°C……60°C下保温8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，分别测定酶活，以初始酶活为100%，测定酶的温度稳定性。

1.9.3金属离子对酶活力的影响

将酶液置于不同离子的反应液中（离子浓度为10 mmol/L），静置过夜。反应液中还含有0.2 M，pH 6.0的Na2HPO4-C6H8O7缓冲溶液。以不添加离子的酶样活性为100%，考察金属离子对酶活力的影响。

2 实验结果

2.1蛋白标准曲线的制作

蛋白标准曲线如图1所示。

图1 蛋白质浓度标准曲线

图2 盐析曲线

2.2盐析曲线的制作

盐析曲线如图2，随着硫酸铵饱和度增大，沉淀中的相对酶活力缓慢增多，表明蛋白质逐步被沉淀，这和硫酸铵盐析的理论一致。当硫酸铵饱和度低于40%时，大部分蛋白酶仍保留在溶液中，相对酶活力较低。而当硫酸铵饱和度至80%，相对酶活力达到最大，大约90%的蛋白酶已经被沉淀。当硫酸铵饱和度超过80%时，部分蛋白质变性，蛋白质析出量减少，相对酶活力急剧下降。可见硫酸铵最适盐析饱和度为80 %。

2.3离子交换层析

经采用不同梯度的缓冲液进行洗脱，确定40%至100%洗脱缓冲液二级洗脱，分离效果最佳。粗酶液经DEAE FF离子交换层析，得到穿透峰和两个洗脱峰，其酶活力如表1所示，所得活力组分主要集中在未吸附的穿透峰，洗脱峰中只有很小的酶活力。将收集到的穿透峰的层析液冷冻干燥浓缩后进行蛋白电泳，考察其分离效果（图3）。可知粗酶液得到部分纯化，由最初的6条条带纯化至3条条带。收集该酶活力组分，为1 mL Phenyl FF(high sub)疏水层析样品。

表1 离子层析穿透峰和洗脱峰的酶活力

表2 疏水层析穿透峰和洗脱峰的酶活力

2.4疏水层析

经采用不同梯度的缓冲液进行洗脱，确定100%洗脱缓冲液梯度洗脱，达到最佳的分离效果。将DEAE FF离子交换层析后得到的穿透峰样品，进行Phenyl FF疏水层析，得到穿透峰和洗脱峰两个峰，其酶活力如表2所示，所得活力组分主要集中在洗脱峰，穿透峰中只有很小的酶活力。将收集到的洗脱峰的层析液冷冻干燥浓缩后进行蛋白电泳，考察其分离效果（图3）。

2.5蛋白电泳检验纯度

通过SDS-PAGE电泳检验得到的蛋白的纯度，如图3所示。图上显示所纯化出来的阿魏酸酯酶的分子量约为30 kDa。从左至右，从泳道3、4可以判断，除了目标蛋白外，没有其他条带，得到了电泳纯的目标蛋白。从表3可以看出，经DEAE-Sepharose Fast Flow纯化后，酶的比活由11.2 U/mg提高到19.8 U/mg，纯化倍数为1.77，回收率为81.5%。通过Phenyl-Sepharose Fast Flow纯化，酶的比活达到29.9 U/mg，纯化倍数为2.67，回收率为55.8%，较好的进行了酶的回收。

图3 蛋白电泳图：泳道1为上样样品(即粗酶液)，泳道2为DEAE穿透峰样品，泳道3、4为Phenyl洗脱峰样品，图中泳道5代表蛋白Marker。

表3 阿魏酸酯酶的纯化

2.6酶学性质研究

2.6.1最适反应pH值和pH值稳定性的测定

经纯化的阿魏酸酯酶在不同pH (4.0-9.0)下进行酶促反应以测定其最适 pH值，结果见图4。纯化的阿魏酸酯酶酶活随着反应液pH值的变化而变化，在pH值较小时，酶活力较低，pH值为6.0时，阿魏酸酯酶酶活最大，随着pH值的继续增大，酶活力缓慢下降。

图4 反应pH对阿魏酸酯酶活性的影响

图5 pH对FAE稳定性的影响

在pH 4.0-9.0范围内，考察了阿魏酸酯酶随时间的pH值稳定性，见图5。结果表明在pH 4.0-6.0之间，酶保持了较高的稳定性，其中pH=5.0的时候酶活稳定性最高。pH值继续增加，酶稳定性下降。

2.6.2最适反应温度和温度稳定性的测定

最适温度的测定是在pH 6.0、0.2 M的Na2HPO4-C6H8O7缓冲溶液体系下进行的酶促反应。结果如图6所示，随温度升高阿魏酸酯酶的酶活力迅速增加，反应温度50°C时，阿魏酸酯酶酶活力最大；当温度超过55°C时酶活力缓慢下降。

图6 反应温度对FAE活性的影响

图7 温度对FAE稳定性的影响

在25°C -60°C考察了阿魏酸酯酶的热稳定性，结果见图7。在25°C-35°C保温120 h，阿魏酸酯酶酶相对活力在80%以上，具有较好的热稳定性。随着温度的增高，阿魏酸酯酶的热稳定性下降。可见阿魏酸酯酶在温度较低的情况下稳定性较强，有利于保存。

2.6.3金属离子对酶活力的影响

为确定金属离子对酶活力的影响，在含有不同10 mmol×L-1一价、二价金属离子的反应液中，考察金属离子对酶活力的影响。以不添加金属离子的酶活力为对照（100%），结果如表4。Cu2+、Zn2+对阿魏酸酯酶酶活力均有明显的抑制作用，Cu2+尤其明显。而Mg2+、Fe2+、对酶活力有一定的促进作用。其余离子对在检测范围对酶活没有显著影响。

表4 金属离子对阿魏酸酯酶酶活力的影响

2.7与其他来源的阿魏酸酯酶比较

本实验纯化的阿魏酸酯酶（FAE-M）与国外的黑曲霉来源的阿魏酸酯酶的理化性质进行比较（表5）[4,5]，发现实验筛选出来的FAE-M与国外的黑曲霉来源FAE-II分子量较为接近，但最适pH差别较大；FAE-M与黑曲霉来源的FAE-III的最适温度和最适pH较为接近，分子量也较为接近。说明所得到的FAE-M可能为一种新酶，仍需进一步研究加以确认。

表5 阿魏酸酯酶的理化性质

3讨论

在本实验中，从菌种的麦糟发酵液中纯化得到一个阿魏酸酯酶的组分，虽然阿魏酸酯酶纯化的研究已有很多报道，但放线菌产阿魏酸酯酶报道较少。经盐析、透析、离子交换层析、疏水层析对阿魏酸酯酶进行分离纯化，得到了电泳纯的目标蛋白。SDS-PAGE电泳确定酶的分子量约为30 kDa。阿魏酸酯酶的纯化倍数为2.67，回收率为55.8%。该酶最适反应pH约为6.0；在pH 4.0-6.0阿魏酸酯酶的稳定性较高；其最适反应温度约为50°C；在25°C-35°C保温120 h后阿魏酸酯酶酶相对活力在80%以上，表明阿魏酸酯酶具有较好的热稳定性。金属离子Cu2+和Zn2+对阿魏酸酯酶酶活力均有明显的抑制作用，而 Mg2+、Fe2+对酶的活性均有一定的促进作用。

实验纯化的阿魏酸酯酶（FAE-M）与国外黑曲霉来源的阿魏酸酯酶的理化性质进行比较，发现实验筛选出来的FAE-M与国外的黑曲霉来源FAE-II分子量较为接近，但最适pH差别较大；FAE-M与黑曲霉来源的FAE-III的最适温度和最适pH较为接近，分子量也较为接近。说明所得到的FAE-M可能为一种新酶，仍需进一步研究加以确认。

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Purification and characterization of ferulic acid esterase from Streptomyces

FAN Yun-min

（Zhangzhou Institute of Technology, Fujian Zhanghzou, 363000）

Ferulic acid esterase produced from the strain was purified by salted out, dialyzed, DEAE-sepharose, Phenyl-sepharose, enzyme specific activity was increased from 11.2 U/mg to 29.9 U/mg and activity recovery reached 55.8%. The molecular mass of this enzyme was estimated to be 30kDa by 0.8% SDS-PAGE. The ferulic acid esterase had an optimal pH value 6.0, and it was stable at pH value 4.0-6.0. Optimal (reaction) temperature of the ferulic acid esterase was 50 ℃, and it was very stable in 25°C-35°C. Metal ions Cu2+, Zn2+had negative effect on FAE, but Mg2+, Fe2+, Ca2+, Na+, Mn2+have promotion effect on FAE.

ferulic acid esterase, purification, physicochemical properties

（责任编辑：季平）

2012－04－15

范韵敏（1984－），女，福建漳州人，助教，工学硕士。

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A

1673-1417（2012）02-0020-06