2种原料药微生物限度检查方法验证

姚 华，潘庭峰

《中国药典》附录微生物限度检查法收载的检验方法包括平皿法和薄膜过滤法2种，笔者通过实验建立了维生素C及柠檬酸三乙酯的微生物检查方法，现报告如下。

1 培养基与药品

1.1 培养基 营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷培养基(MUG)，上述培养基均由中检所提供。稀释剂:0.9%氯化钠溶液。

1.2 药品 维生素 C(蚌埠泰格药业有限公司，批号:0908189、0908190、0908191)、柠檬酸三乙酯(蚌埠丰原医药科技发展有限公司，批号:080107;080109;080111)。

1.3 菌种 大肠埃希菌［CMCC(B)44 102］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63 501］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98 003］，以上菌种均购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备 取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌营养肉汤液体培养基的培养物1 ml加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10 倍稀释至10－4～10－7约为50～100 cfu/ml备用。

取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌改良马丁培养基内的液体培养物1 ml，加入9 ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5约为50～100 cfu/ml备用。

取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液3 ml，洗脱孢子，取孢子悬液1 ml加入9 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4～10－6约为50～100 cfu/ml备用。以上各株菌的培养物均为第二代的培养物。

2.2 样品的制备 取样品各10 g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100 ml，边加边搅拌，混匀，作为1:10的供试液。由于柠檬酸三乙酯为非水溶性供试品，故加入适量司盘80、单硬脂酸甘油酯和聚山梨酯80使其充分乳化后，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1:10的供试液;由于维生素C溶于水后pH值较低，预实验时发现影响部分菌种的正常生长，故在制备成1:10的供试液后用无菌碳酸氢钠调节pH值至中性。……