健脾复方对人大肠癌移植瘤裸小鼠肿瘤细胞凋亡的影响

刘 静,朱 琰,史 勤,吕 祥,冯彦军

(1.上海市中医医院肿瘤科,上海,200071;2.上海中医药大学附属曙光医院药剂科,上海,200021)

我国大肠癌发病率和病死率在恶性肿瘤中占第5位[1],而在上海等大城市已成为继肺癌之后的第二位高发肿瘤。由于各种原因,我国大肠癌的患者以进展期居多,而目前进展期大肠癌术后仍有近50%的患者发生复发或转移,5年生存率仅为40%～50%[2]。祖国医学中,健脾益气法是大肠癌防治工作中重要的手段之一[3]。本研究通过观察健脾复方对人大肠癌原位移植瘤裸小鼠肿瘤细胞凋亡的影响,来探讨健脾复方对大肠癌发生发展的抑制作用,并研究其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本次研究由中科院上海实验动物中心提供53只BALB/C裸小鼠,雌雄不限,无特定病原体(SPF)级,4～6周龄,体重18～20 g,并在上海中医药大学动物实验室(许可证号:SYXK[沪]2004 -2005)进行饲养,按SPF级要求,并进行自由饮食。

1.2 造模

1.2.1 制备原位移植瘤块:取3只BALB/C裸小鼠,对数生长期的大肠癌HT-29细胞(由上海市肿瘤研究所提供)制备成单细胞悬液,调整细胞浓度至8×107/mL,右侧腋下皮下注射,剂量为0.1 mL/只,连续观察28 d,直至皮下瘤直径达1 cm时将裸小鼠处死,并切下瘤块,将坏死部分去除,分理出其中淡黄色或呈鱼肉状的瘤块,置于生理盐水中,再剪成直径为2 mm的小瘤块备用。1.2.2 制作原位移植瘤模型[4]:将40只BALB/ C裸小鼠术前禁食12 h,氯胺酮腹腔内麻醉,仰卧固定,以下腹正中切口打开腹腔,用手术刀在距盲肠末端1 cm处肠系膜侧的浆膜面轻轻刮伤浆膜层,再将直径为2 mm的小瘤块用OB胶黏附在裸小鼠肠壁上,以无损伤缝线全层缝合,检查无活动性出血后关腹。术后所有裸小鼠暂时分笼饲养至完全清醒。整个手术过程在切除皮下瘤后1 h内完成。另10只裸鼠行假手术后作为正常对照组。

1.3 药物制备

1.3.1 健脾复方的制备:由上海市中医医院制剂室协助制备。健脾复方的药物比例为:黄芪30 g,党参12 g,炒白术12 g,茯苓12 g,半夏9 g,天龙6 g,红藤30 g,藤梨根30 g,生牡蛎30 g,炙甘草6 g。根据该处方比例,取生药900 g,浓煎至300 mL,含生药3 g/mL。

1.3.2 塞来昔布溶液制备:将塞来昔布胶囊(商品名:西乐葆,辉瑞制药有限公司生产)磨粉,用无菌蒸馏水溶解,每mL含塞来昔布1.33 mg,由上海市中医医院制剂室协助制备。

1.3.3 5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液:由上海旭东海普制药有限公司生产,规格为10mL∶0.25g。

1.4 分组与给药方案

将53只BALB/C裸小鼠随机分为5组:健脾复方组、塞来昔布组、5-Fu组、模型对照组和空白对照组,每组10只。健脾复方组予健脾复方灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理盐水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。塞来昔布组予塞来昔布溶液灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理盐水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。5-Fu组予生理盐水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+5-Fu腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。模型对照组予生理盐水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理盐水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。正常对照组予生理盐水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理盐水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。5组均于成功造模后第2天开始给药,共8周。所有实验动物均给予饲料饼喂养,并自由饮用消毒水。

1.5 标本处理

5组裸小鼠均于成功造模后8周处死,之后立即将腹腔打开,并将肿瘤组织取出。取小块肿瘤组织立即-80℃液氮保存,其余组织(空白对照组取肠组织)采用10%甲醛溶液固定,并酒精梯度脱水、石蜡包埋后,切片厚度约6μm,再用苏木精染色,最后送病理科。

1.6 指标检测方法

免疫组化法检测信号转导与转录激活因子-3(Stat-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、存活素(Survivin)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Cas2 pase-8和Caspase-9的表达,试剂由 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC提供,严格根据说明书进行检测。

表1 免疫组化法检测各组裸小鼠凋亡因子表达结果(n=10,±s,ng/L)

表1 免疫组化法检测各组裸小鼠凋亡因子表达结果(n=10,±s,ng/L)

3采用广义线性模型进行组间比较;采用LSD法与模型对照组比较,##P<0.01;采用LSD法与塞来昔布组比较,△P<0.05,△△P<0.01;采用LSD法与5-Fu组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;采用LSD法与空白对照组比较,☆☆P<0.01

指标 健脾复方组 5-Fu组 塞来昔布组 模型对照组 空白对照组 P值3 Stat-3 0.14±0.02## 0.17±0.03 0.15±0.03## 0.23±0.03 0.14±0.07## 0.0389 Survivin 0.12±0.04△▲▲ 0.18±0.02 0.16±0.03 0.15±0.03▲ 0.10±0.03##△△▲▲ 0.0050 Bcl-2 0.11±0.03##▲▲ 0.18±0.03☆☆ 0.13±0.03▲▲☆☆ 0.15±0.03 0.09±0.02## 0.0006 Caspase-9 21.22±7.01##▲▲ 11.48±4.98 23.96±6.22##▲▲ 9.36±2.65 20.58±13.76##▲▲ 0.0012 Caspase-8 17.69±11.77## 11.41±2.61##△△ 19.27±6.85## 3.12±1.20 8.54±4.80△△ 0.0005 Caspase-3 18.60±11.45## 10.68±3.27 14.61±4.68 5.91±3.27 20.44±18.16## 0.0071

2 结 果

2.1 Stat-3的表达

5组裸小鼠肠组织的Stat-3表达见表1。经广义线性模型检验,F=10.09,P=0.0389。经LSD法两两比较,健脾复方组、塞来昔布组和空白对照组Stat-3表达显著低于模型对照组(P<0.01)。

2.2 Survivin的表达

5组裸小鼠肠组织的Survivin表达见表1。经广义线性模型检验,F=14.86,P=0.0050。经LSD法两两比较,健脾复方组和空白对照组Survivin表达低于5-Fu组、塞来昔布组;空白对照组Survivin表达低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)。

2.3 Bcl-2的表达

5组裸小鼠肠组织的Bcl-2表达见表1。经广义线性模型检验,F=19.76,P=0.0006。经LSD法两两比较,健脾复方组、塞来昔布组和空白对照组Bcl-2表达低于模型对照组;健脾复方组、塞来昔布组Bcl-2表达低于5-Fu组;5-Fu组和塞来昔布组Bcl-2表达高于空白对照组(P<0.01)。

2.4 Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表达

5组裸小鼠肠组织的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达见表1。Caspase-9的表达经广义线性模型检验,F=18.13,P=0.0012。经LSD法两两比较,健脾复方组、塞来昔布组和空白对照组Caspase-9表达高于模型对照组和5-Fu组(P<0.01)。Caspase-8的表达经广义线性模型检验,F=20.00,P=0.0005。经LSD法两两比较,健脾复方组、塞来昔布组和5-Fu组Caspase-8表达高于模型对照组;塞来昔布组的Caspase-8表达高于5-Fu组和空白对照组(P <0.01)。Caspase-3的表达经广义线性模型检验,F=14.06,P=0.0071。经LSD法两两比较,健脾复方组、空白对照组Caspase-3表达高于模型对照组(P<0.01)。

2.5 病理结果

健脾复方组、塞来昔布组、5-Fu组、模型对照组各裸小鼠取得的瘤块组织均为低至中度分化腺癌,癌细胞异型性明显,多呈实体状排列,部分呈腺样排列,肿瘤间质少,均有不同程度的肿瘤组织坏死和炎细胞浸润。

3 讨 论

临床研究提示健脾复方联合化疗在大肠癌术后患者中显示了一定的疗效,不仅能够改善患者的临床症状,减少不良反应,而且能够提高患者生存率[5-9]。细胞凋亡异常是肿瘤发生发展的主要因素,那么健脾复方是否也能通过对细胞凋亡的调控,从而影响到大肠癌的发展呢?已有报道[10]通过胃癌移植瘤裸小鼠模型,显示健脾方药活化Caspase-9和Casepase-3,实现体内诱导肿瘤细胞凋亡,其机制与下调Stat-3和Bcl-2的表达、抑制 P-Stat-3和Bcl-2在细胞内表达有关,但是很少有研究探讨健脾中药对大肠癌细胞凋亡的影响。

这些基因中既可能单独调节细胞凋亡,也可相互影响,相互作用。Stat-3是转录信号转导子与激活子家族的重要成员,通过激活下游癌基因,使抑癌基因失活,从而改变细胞周期进程,阻断细胞凋亡,使肿瘤获得不断增殖的能力。Stat -3下游目的基因包括Bcl-2和Survivin。Sur2 vivin是处于细胞增殖与细胞死亡界面的分子,通过内源性及外源性途径最终作用于天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspases)家族,抑制细胞凋亡[11]。Bcl-2也可阻断细胞色素c从线粒体释放,从而影响Caspase家族抑制细胞凋亡。含有半胱氨酸的Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶,现已确定至少存在11种Caspase,Caspase家族又可分为起始Caspase和执行 Caspase,其中 Caspase-8和Caspase-9参与细胞凋亡的起始;Caspase-7参与细胞凋亡的执行。在凋亡信号的作用下,细胞色素c从线粒体释放出来,激活Caspase-9前体转变成Caspase-9,后者再激活Caspase-3,激活的Caspases引起DNA断裂和细胞骨架成分降解。

研究发现塞来昔布可抑制结肠癌的发生和转移,促进细胞凋亡等作用[12],因而塞来昔布对大肠癌的治疗作用也被广泛研究。本研究也将其作为对照组之一,结果显示塞来昔布对大肠癌细胞凋亡有一定的调控能力,与文献报道[12]一致。

本研究结果显示,大肠癌组织中Stat-3、 Bcl-2、Survivin和Caspase-9、Caspase-8、Cas2 pase-3的表达均异常,证实了在大肠癌中存在细胞凋亡的异常。健脾复方能下调Stat-3、Bcl-2的表达,上调Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3的表达,最终促进细胞凋亡的发生。这些结果提示了健脾复方抑制大肠癌发展的作用途径之一是抑制大肠癌的细胞凋亡[13-14]。健脾复方对于凋亡因子的调控也有优于其他治疗组的趋势。但本研究仍有不确定的结果,例如健脾复方对于Sur2 vivin的调节作用有待于进一步的实验进行确定。

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