高效液相色谱法测定昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量

(广西壮族自治区百色食品药品检验所，广西 百色 533000)

昆明山海棠 Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch.是卫矛科 Celastraceae雷公藤属植物，所含生物碱类(包括雷公藤次碱、雷公藤春碱、雷公藤吉碱)、二萜类(主要成分是环氧二萜内酯化合物如雷公藤内酯、雷公藤内酯酮、雷公藤内酯醇、雷公藤甲素)、三萜类(雷公藤酯甲、雷公藤酯乙、山海棠内酯)及其他如β－谷甾醇葡萄糖苷、表儿茶素、对羟基苯甲酸等化学成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗生育等药理活性，临床常用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、白血病、红斑狼疮等疾病[1]。昆明山海棠片为昆明山海棠经加工制成的薄膜衣片或糖衣片，收载于2010年版《中国药典(一部)》，其质量标准采用回流提取测定总生物碱的含量[2]。近年来，采用高效液相色谱法测定昆明山海棠片中雷公藤甲素的含量已有报道[3]。本试验中建立了高效液相色谱法测定昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量的方法，取得了良好的结果，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括G1322A在线脱气、G1311A四元泵、G1314B VWD紫外检测器、安捷伦化学工作站软件;AND GR－202型电子天平。雷公藤酯甲对照品(中国药品生物制品检定所，批号为111597－200301);昆明山海棠片(市售，均为糖衣片);甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:Phenomenex GeminiC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:0.02mol/L磷酸二氢钾溶液－乙腈(32∶68);流速1.0mL/min;检测波长:210 nm;柱温:室温;进样量:10 μL。理论板数按雷公藤酯甲峰计应不低于3 000。雷公藤酯甲峰保留时间为25.7 min，阴性对照品溶液不干扰测定，见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

取雷公藤酯甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含50 μg的溶液，即得对照品溶液。取昆明山海棠片20片，除去包衣，研成细粉，精密称取适量(相当于2.5片)，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声提取30 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得供试品溶液。根据处方和工艺，照供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察:精密称取雷公藤酯甲对照品11.25 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含雷公藤酯甲 0.45 mg 的贮备液，精密量取贮备液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置 25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，分别进样10 μL测定。以峰面积 A对质量浓度C(μg/mL)进行回归处理，回归方程为 A=3.461 1 C+0.900，r=0.999 7(n=5)。结果表明，雷公藤酯甲质量浓度在 18.0～90.0 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验:取质量浓度为54.0 μg/mL 的溶液，进样 10 μL，连续进样6次。结果雷公藤酯甲峰面积的 RSD为0.36%(n=6)，表明进样精密度良好。

重复性试验:取同一批样品5份，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，在拟订的色谱条件下进行分析测定。结果雷公藤酯甲含量平均值为0.6%，RSD=0.91%(n=5)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8 h 时进样测定。结果雷公藤酯甲峰面积的 RSD为0.62%(n=5)，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

加样回收试验:精密称定已测知含量的样品(每片含雷公藤酯甲1.28 mg)粉末适量(相当于1片)，共6份，置50 mL量瓶中，分别精密加入含雷公藤酯甲对照品溶液(浓度为0.505 5 g/L)1.0，2.5，4.0 mL，按供试品溶液制备方法制备待测溶液并依法测定。按外标法以峰面积计算含量，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取昆明山海棠片20片，依法制备供试品溶液。取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=4)

3 讨论

曾比较了无水乙醇和甲醇对昆明山海棠片中雷公藤酯甲的提取效率，结果二者所得峰面积相近、峰形良好，但以乙醇作供试品溶剂时，进样后会出现较大的前延峰，故采用甲醇提取。

超声提取时间(15，30，60 min)的考察结果表明，用甲醇超声提取30 min和60 min的含量相差不大，表明30 min超声提取完全。因此，选择以甲醇超声提取样品30 min。

昆明山海棠片的甲醇提取液呈棕红色，所含成分较多，极性差别大，文献[4]认为直接进样会污染色谱柱，且分离效果差，故样品预处理时都要过氧化铝柱。本试验参考文献[5]，创新地将昆明山海棠片样品以甲醇提取后直接测定，在雷公藤酯甲质量浓度为 18.0～90.0 μg/mL范围内采用 C18色谱柱，控制适宜的流动相洗脱强度，可使雷公藤酯甲较好地与其他成分分离，避免了提取过程中的损失，达到了简化操作的目的。

本试验测定了3个厂家的4批产品，结果表明，不同厂家生产的昆明山海棠片中雷公藤酯甲含量为0.78～1.28 mg，这可能是由所用的昆明山海棠药材产地、采收期及生产工艺的差异造成。本法具有简便快速、重现性好的优点，可用于昆明山海棠片的质量控制。

[1]王 钺，隆长锋.中药昆明山海棠的研究进展[J].医学综述，2006，12(11):691－692.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:812－813.

[3]李胜容，王贤英.HPLC法测定昆明山海棠片中雷公藤甲素的含量[J].药物分析杂志，2008，28(7):1 150－1 152.

[4]陈晓明.高效液相色谱法测定雷公藤饮片中雷公藤内酯醇的含量[J].中国药房，2006，17(9):696－697.

[5]黄秀旺，许建华，陈元仲.高效液相色谱法测定雷公藤片中雷公藤甲素含量的方法改进[J].海峡药学，2009，21(12):57－58.