杨梅果醋体外抗氧化活性的研究

谢思芸 钟瑞敏， 肖仔君 邓泽元

（1.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330047；2.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东 韶关 512005）

杨梅（Myrica rubra Bied.Et Zucc.）是原产于中国的亚热带水果之一，富含花色苷、黄酮等多酚类物质。多酚类物质存在于多种水果蔬菜中，具有良好的抗氧化［1，2］、抗菌［3］、抗突变［4－6］等作用。近年来，国内外学者对杨梅果实及其枝叶等的有效成分进行了较深入的研究［7－9］，先后分离鉴定了矢车菊－3－葡萄糖苷、杨梅素、槲皮素、没食子酸等活性成分，并指出其抗氧化能力与这些活性成分的浓度呈正相关。

果醋是利用水果及水果下脚料通过微生物发酵得到的一类新型饮品，多项研究［10－12］指出，因果醋发酵条件比较温和，能够有效保留果品中的营养成分和多酚类活性物质，同时，微生物在发酵过程中产生了多种活性物质，如琥珀酸等有机酸，这些物质都具有一定的抗氧化能力。

杨梅果醋是杨梅果汁经酒精发酵和醋酸发酵后所得的酸性饮品。目前，对杨梅果醋的研究主要集中在发酵工艺、饮品调配和相关营养成分检测等方面［13－15］。对其抗氧化能力的评价则较少涉及。本试验主要探讨不同酿造工艺及原料对体外抗氧化能力的影响，为以后杨梅果醋功能饮品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

杨梅果汁：广东始兴县野生青蒂品种，始兴绿而健食品有限公司；

杨梅果酒、杨梅果醋和苹果醋：本实验室自制；

酵母菌：安琪酵母公司；

恶臭醋酸杆菌（AS1.41）：广东省菌种保藏中心；

高粱醋：2年陈酿产品，山西水塔醋业有限公司；

1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）：美国Sigma公司；

三氯乙酸、水杨酸钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

三氯化铁、铁氰化钾：分析纯，天津市福晨化学试剂厂；

过氧化氢：分析纯，天津市百世化工有限公司；

硫酸亚铁：分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 主要仪器设备

台式离心机：TGL－16C，上海安亭科学仪器厂；

数显恒温水浴锅：HH－S，6S，江苏大地自动化仪器厂；

可见分光光度计：722N，上海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杨梅果酒酿造工艺

杨梅果汁→酶解→调节糖度→巴氏灭菌→降温接种（0.2%酵母菌，30 ℃）→搅拌发酵（24h）→静置发酵至酒精度达6% （V／V）

1.3.2 杨梅果醋酿造工艺

杨梅果酒→巴氏灭菌→快速降温→分别接种于10L 和50L含灵芝粒载体发酵罐（2%醋酸菌，30 ℃）→通氧搅拌恒温发酵→以酸度不再变化为发酵终点→将醋液混合，调节酸度为4%

1.3.3 苹果醋酿造工艺

（1）苹果酒：清洗→打浆→酶解→过滤→苹果汁。按杨梅果酒方法发酵成苹果酒。

（2）苹果醋：苹果果酒→巴氏灭菌→快速降温→分别接种于10L和50L 发酵罐（2%醋酸菌，30 ℃）→通氧搅拌恒温发酵→以酸度不再变化为发酵终点→将醋液混合，调节酸度为4%。

1.3.4 样品预处理 经上述方法所得的样品，再经300目滤布过滤、离心后，上清液为试验样液，假定质量分数100%为未稀释样液，试验时用蒸馏水稀释到所需质量分数。

1.3.5 抗氧化活性的测定方法

（1）羟自由基（·OH）清除率：本体系利用Fenton反应产生羟基自由基，即H2O2与Fe2＋混合后产生·OH，当体系存在水杨酸，能有效俘获·OH 并生成红色产物，此物质在510nm 处有最大吸收。根据文献［16～18］，修改如下：依次向试管中加入0.5mL FeSO4溶液（0.15mol／L）、2mL水杨酸钠溶液（2mmol／L）、2.5mL 蒸馏水和1 mL 不 同质量分 数（6%，10%，14%，20%，30%，40%，50%，60%）的 样 液，最后加入1 mL H2O2（6 mmol／L）启 动 反 应，37 ℃下 反 应1h，离心取上清液，510nm 处测吸光度。按式（1）计算·OH清除率：

式中：

E—— 羟自由基清除率，%

A0—— 空白对照液的吸光度；

Ai—— 加入样品后的吸光度；

Aj—— 样品溶液的本底吸光度。

（2）DPPH 自由基清除率：根据文献［19］、［20］，修改如下：准确移取5mL DPPH 溶液（6.0×10－5mol／L），加入0.6 mL不 同 质 量 分 数（5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%）的样液，混匀，黑暗中放置30min后，离心取上清液，517nm 处测吸光度。按式（2）计算DPPH 自由基的清除率：

式中：

E——DPPH 自由基清除率，%；

A0—— 蒸馏水加DPPH 溶液的吸光度；

Ai—— 样液加DPPH 溶液的吸光度；

Aj—— 样液加乙醇溶剂的吸光度。

（3）还原能力：参照文献［21］，取1 mL 不同质量分数（5%，10%，15%，20%，25%）的样液，依次加入0.2mL PBS缓冲液（0.2mol／L，pH 6.6）和0.5mL K3Fe（CN）6（1%），混匀，50 ℃下水浴20min，取出，流水冷却，再加入1mL 三氯乙酸（10%）终止反应，3 000r／min下离心10min，取1.5mL上清液，加入0.2mL FeCl3（1%）和3.0mL蒸馏水，摇匀，静置5min，于700nm 处测定吸光值。

2 结果与讨论

2.1 清除羟自由基（·OH）能力

2.1.1 杨梅果汁、果酒、果醋清除羟自由基（·OH）的能力

由图1可知，杨梅果汁、果酒及果醋对羟自由基均具有良好的清除能力，在试验浓度范围内，其清除能力随浓度增加而增强。当体积分数低于14%时，杨梅果醋较杨梅果汁及果酒而言，清除能力较差，清除率约为30%。随着试验浓度增大至20%，杨梅果醋对羟自由基的清除率持续显著上升，高达87.6%，而此时杨梅果汁及果酒清除率分别为92%和93.6%。随着浓度增加，三者间的清除能力相当，当达到最大的试验浓度（60%），杨梅果醋的清除率为96.7%，而杨梅果汁和果酒均达到98.6%。虽然在较低浓度时，杨梅果醋的清除效果仅为杨梅果汁的1／3，但当浓度上升至40%，二者清除率并无显著差别，总体说来，杨梅果醋在经过长时间发酵后，清除能力仍有较好的保留。

2.1.2 杨梅果醋、苹果醋、高粱醋清除羟自由基（·OH）的能力 由图2可知，在相同的酸度下（6%），3种醋样清除羟自由基的能力因原料及发酵工艺不同而有明显差异，随着体积分数增加，其清除能力相应增强，呈浓度效应。在体系浓度低于14% 时，以高粱醋的清除效果最佳，清除率为65.1%，苹果醋则最差，清除率仅有15.5%，而杨梅醋清除效果居中，清除率为30%。当浓度达30%以上，杨梅醋清除效率明显提高，与高粱醋相当，当达到最大试验浓度时，清除率分别高达96.7%和97.1%。相比较，苹果醋的清除能力较差，随浓度增加，清除效果变化不大，最高为43.3%，清除能力仅为杨梅醋的一半。说明杨梅果醋对羟自由基的清除率明显优于苹果醋，原因可能在于多酚类成分等具备抗氧化能力的物质在二者间的含量不同，而且在果醋酿造过程中，固定化发酵的方式与游离细胞发酵的方法相比，前者能有效缩短发酵时间，有利于此类物质的保留。

图1 杨梅果汁、果酒、果醋对羟自由基的清除作用Figure 1 Scavenging effects among bayberry juice，wine and vinegar on hydroxyl free radicals

图2 杨梅果醋、苹果醋、高粱醋对羟自由基的清除作用Figure 2 Scavenging effects among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar on hydroxyl free radicals

2.2 清除DPPH 自由基能力

2.2.1 杨梅果汁、果酒、果醋清除DPPH 自由基的能力

DPPH 自由基是一种稳定的、以氮为中心的自由基，如果受试物能将其清除，则意味着受试物具有降低烷自由基或过氧化自由基的能力，同时能打断脂质过氧化链反应的作用。由图3可知，3种样液对DPPH 自由基都具有良好的清除作用，随着样液浓度增加，清除效果显著增强。其中，杨梅汁和杨梅酒清除能力相当，二者在10%的体积分数下，清除率均超过50%，当体积分数达35%时，随着浓度增加，两者对DPPH 的清除能力趋于稳定，杨梅酒对DPPH 自由基清除率达100%，而杨梅汁的清除率也达85.3%。相比之下，杨梅醋的清除效果较好，图中曲线相对平缓，随着浓度增加，其DPPH 清除能力也逐步增强，在最大试验浓度时清除率为80.2%，清除效果与杨梅汁相当。

2.2.2 杨梅果醋、苹果醋、高粱醋清除DPPH 自由基的能力

图3 杨梅果汁、果酒、果醋对DPPH 自由基的清除作用Figure 3 Scavenging effects among bayberry juice，wine and vinegar on DPPH·

图4 杨梅果醋、苹果醋、高粱醋对DPPH 自由基的清除作用Figure 4 Scavenging effects among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar on DPPH·

由图4可知，3种醋样对DPPH 自由基清除能力具有显著的差异。在最低浓度下（5%），高粱醋的清除效果很好，清除率接近90%，而杨梅醋的清除率为18.7%，苹果醋则小于6%。随着浓度增加，杨梅醋的清除率明显增强，而高粱醋和苹果醋则变化不大。当达到最高浓度（50%），高粱醋清除率达98.7%，杨梅醋为85.3%，相比较而言，苹果醋对DPPH自由基几乎没有清除作用，即使在最大浓度下，其清除率约为11%，仅为高粱醋的1／9，杨梅醋的1／8。

2.3 还原能力

2.3.1 杨梅果汁、果酒、果醋的还原能力 一般而言，当一种物质具有较强的还原能力，相应的也具有较强的抗氧化能力。根据1.3.5（3）中的方法，若样液在700nm 处吸光值越大，则其将Fe3＋转化Fe2＋的量及生成的普鲁士蓝的量越多，表明其还原能力越强，即抗氧化能力越好。由图5可知，3种样液都具有较好的还原能力。其中，杨梅汁的还原能力最大，杨梅酒次之，杨梅醋最低。

2.3.2 杨梅果醋、苹果醋、高粱醋的还原能力 由图6 可知，杨梅醋和高粱醋的还原能力相当。高粱醋的还原能力随着样液浓度增大而不断增强，体积分数达20%时，其还原力趋于稳定，而杨梅醋则仍处于显著上升趋势。而苹果醋还原能力明显低于其它两种醋样。

图5 杨梅果汁、果酒、果醋还原能力测定Figure 5 Reducing capacity among bayberry juice，wine and vinegar

图6 杨梅果醋、苹果醋、高粱醋还原能力测定Figure 6 Reducing capacity among bayberry vinegar，apple vinegar and sorghum vinegar

综上所述，经酒精发酵和醋酸好氧发酵制备的杨梅果醋，与杨梅果汁相比虽然其抗氧化能力有所下降，但仍然具备比较理想的抗氧化活性。果醋所经历的二次发酵会造成杨梅多酚类物质的损失，尤其是醋酸发酵过程中的持续供氧易造成抗氧活性物质的化学性氧化而损失部分抗氧化能力。由于固定化发酵时间相对较短，可减少因好氧发酵供氧造成的抗氧化物质的损失，因此固定化发酵制备的果醋抗氧化能力远远大于游离细胞发酵的果醋。本试验选取的市售高粱醋对照样品抗氧化活性最强（该产品以富含多酚类抗氧化物质的高粱、豌豆为主要原料酿造），这也说明中国北方地区生产的一些以高粱为主料的食醋拥有良好的保健价值。

3 结论

本试验结果表明，采用固定化细胞发酵的杨梅原醋含量达30%以上配制的杨梅果醋饮料仍然表现出良好的抗氧化能力。杨梅果醋饮料中的原醋比例为35%～50%时，具有较好的酸感和风味。因此，采用杨梅果醋不仅可调配风味适宜的果醋饮料，同时还拥有良好的抗氧化活性，具有开发应用价值。

后续研究拟通过在果酒和果醋发酵过程中添加具有抗氧化能力的物质来保护原汁中的有效成分，或通过浅度发酵果酒并制备醋酸含量相对较低的杨梅果醋来缩短发酵时间以保护杨梅汁中多酚类成分，使杨梅果醋抗氧活性进一步提高。

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