蛋白质组学及其在奶牛蹄叶炎研究中的应用前景

董书伟，李 巍，严作廷，王旭荣，高昭辉，荔 霞＊

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室／甘肃省中兽药工程技术中心，甘肃兰州730050；2.郑州牧业高等专科学校，河南郑州450000；3.甘肃省牦牛繁育重点实验室，甘肃兰州730050）

随着奶牛养殖业的规模化和集约化发展，口蹄疫、结核病和布鲁氏菌病等传染病已经得到了有效的控制，而蹄病作为奶牛的常见病，却成为了危害奶牛生产的三大疾病之一。据报道［1］，我国每年因蹄病被迫过早淘汰的奶牛占总淘汰头数的15%～30%，给奶牛业造成经济损失达2 250万元。李玉文等［2］调查了唐山市奶牛发病情况，发现因患乳房炎而被淘汰的奶牛占到32%，因患蹄病而被淘汰的奶牛占到21.5%，由此可见，蹄病对奶牛生产的影响仅次于乳房炎，已成为当地引起奶牛淘汰最多的第二大疾病。

蹄叶炎是奶牛最为常见的一种蹄病，41%的蹄病是蹄叶炎，72%的奶牛至少有一个蹄发生过此病［3］。据杨前锋调查［4］，豫北某奶牛场在春夏季蹄叶炎发病率高达18%，可见奶牛蹄叶炎发病率较高。由于蹄叶炎可导致奶牛蹄变形，蹄底溃疡及白线病等多种蹄病，引起奶牛疼痛不安，严重影响了奶牛福利，导致奶牛生产性能明显下降［5］，造成了很大的经济损失，制约了奶业的健康发展，因此，对该病开展病因、发病机理、诊断和防治等方面的研究，为控制奶牛蹄叶炎，提高奶牛生产性能和改善动物福利，具有重要的实用价值和现实意义。

蛋白质组学是生命科学研究进入后基因组时代的重要标志，已成为生命科学研究的重要技术手段，被广泛应用于生命科学研究的多项领域［6］。因此，应用蛋白质组学研究奶牛蹄叶炎，能进一步在蛋白水平揭示其发病机制，为该病的诊断与治疗提供新的理论依据，并为其防治药物的研发提供新思路，开辟新途径。本文综述了奶牛蹄叶炎的主要研究进展，并探讨了蛋白质组学在该病研究中的应用前景和价值。

1 奶牛蹄叶炎的研究现状

1.1 奶牛蹄叶炎的病因

奶牛蹄叶炎是蹄壁真皮乳头层和血管层的弥漫性、浆液性、非化脓性炎症［7］。由于蹄叶炎发生多呈慢性经过，从表面上看不出对奶牛生产和繁殖性能的影响，因此，未引起饲养管理者的足够重视，致使蹄叶炎成为奶牛的一个隐形杀手。

长期以来，普遍认为奶牛蹄叶炎是机体代谢紊乱的局部表现［7］；乳酸、内毒素和组织胺是诱发该病的主要因素［8-9］。但多数学者认为，蹄叶炎是由综合因素所致，包括日粮中碳水化合物过多、疾病、遗传和管理等多种因素［10］。蹄形不正，如高蹄、低蹄、过长蹄等，使蹄的机能发生障碍，影响蹄部血液循环也会诱发本病；还有蹄叶炎继发于瘤胃酸中毒、胎衣不下、乳房炎、子宫内膜炎、酮病等［11］。另外，管理不善也会诱发蹄叶炎，包括圈舍条件，特别是地面质量、有无垫草及奶牛运动量等［12］。奶牛妊娠后期，后肢水肿，使蹄部真皮层的抵抗力降低；持续而不合理的过度负重；甲状腺机能减退等都可能是诱发本病的因素。

1.2 奶牛蹄叶炎的发病机制

由于蹄叶炎的病因比较繁杂，其发病机理也尚无定论，因此，截止目前，还没有成功建立起公认的奶牛蹄叶炎病理模型［13］。但是，在发病机理方面比较普遍的观点是：蹄部组织由于血液回流阻力大和久负重体，再加上血管活性物质的共同作用，引起蹄组织毛细血管充血、淤血，血液回流受阻，导致蹄局部微循环障碍，蹄组织供氧不足，代谢紊乱，使蹄组织处于 “临界应激”状态，极易发生蹄叶炎［3，14］。Morgan S J等［15］通过观察蹄叶炎组织病理学的变化，发现单层上皮黏膜受损，趾间血管的血液灌注量不足，鳞状细胞分离和退化，真皮层毛细血管内存在血栓和脉管炎，这可能是导致蹄叶炎的潜在原因。

近年来，很多学者开始关注金属蛋白酶对基底膜的破坏作用，发现蹄部薄膜组织结构中存在有金属蛋白酶MMPs，能催化降解蹄部许多重要的组织结构，如基底膜（BM）、半细胞桥粒（上皮细胞膜中的局部增厚组织），最终使BM和基部上皮细胞分离，使组织结构丧失生物学功能，在机体健康情况下，这些金属酶处于钝化态，不具有催化活性。当有大量的微生物代谢毒素时，这些酶被激活，从而引起薄膜组织结构的损伤［16-17］。含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 （ADAMTS）也有相同的作用，迄今共发现有19个金属蛋白酶成员，它们在维持凝血系统的稳定、器官生成、炎症和发育等方面有重要作用，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5在哺乳动物关节炎炎症中起关键作用［18］。试验证明［19］，几种细菌内毒素可不同程度的激活MMP-2和MMP-9，虽然ADAMTS-4和ADAMTS-5的激活机制还不清楚，但是，MMP-2和ADAMTS-5在降解细胞外基质中可能起关键作用［20］。当奶牛采食大量精料时，瘤胃中以牛链球菌为主的有害菌，能在充足的底物、较低的pH环境中迅速繁殖为优势菌株，将碳水化合物降解为以L-乳酸为主的酸类，而细菌自身代谢的内毒素和其他血管活性物质则通过血液循环，激活蹄部真皮毛细血管壁中的金属蛋白酶，使血管壁的通透性增强，也可引起红细胞和血小板凝聚，形成血栓；使生角质细胞发生营养供应不足，从而合成角质出现障碍［21］。另一方面，瘤胃内乳酸含量升高，pH下降，在多种细菌作用下，组氨酸脱羧，产生大量的组胺，作用于蹄部真皮，引起淋巴停滞、严重充血和血管损伤，最终引起蹄叶炎［22］。

经过国内外学者几十年的坚持不懈的努力研究，在奶牛蹄叶炎的病因和发病机理方面都做了大量的工作，但是，至今其发病机理尚无定论，并且大多数研究都仅仅关注组织中单个致病因素，而没有从整体上系统的筛选，不足于深入认识 “蹄叶炎是全身代谢紊乱的局部表现”，那么，奶牛发生蹄叶炎后，机体内的全部蛋白质表达发生了什么样的变化？这些变化之间又存在着怎样的联系？它们在蹄叶炎的发生发展过程中起着怎样的作用呢？截至目前，国内外尚未见到类似研究和报道。研究这些关键科学问题，是摆在我们科研工作者面前的巨大挑战。如今，传统的科研方法对研究蹄叶炎这一复杂疾病已有点力不从心，那么借助新兴的科学技术和方法，从崭新的视角去审视这一顽固的疾病，另辟蹊径，或许会给我们提供新的思路。

2 蛋白质组学的研究现状

2.1 蛋白质组学的研究内容

蛋白质组于1994年由Wilkins和Williams提出［23］，是指一种细胞、组织或机体在特定的生理或病理时期，表达的全部蛋白质整体；蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，在整体水平上研究所有蛋白质的组成、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系及其变化规律的学科［24］。其主要研究内容有：①功能蛋白质组学：鉴定某个体系的蛋白质组所有组分，并阐述其修饰特性及功能；②差异蛋白质组学，即比较蛋白质组学：以重要生理现象或疾病为对象，比较细胞或机体在生理和病理过程中的蛋白质表达变化，寻找疾病的特异性标志蛋白或新的药物靶标，为重大疾病的发病机理、早期诊断和防治提供理论和物质基础［25］，也为筛选药物靶标分子提供了新的思路；③相互作用蛋白质组学：利用多项技术研究蛋白质之间的相互作用网络，绘制某个体系内蛋白质间相互作用和联系的网络图谱［26］。

2.2 蛋白质组学的主要研究技术

蛋白质组学研究的主要技术有基于凝胶技术和质谱技术两大类，包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术和生物信息学分析，其特点是采用高分辨率的蛋白质分离方法和高通量的蛋白质鉴定技术，全景式地展现蛋白质表达图谱，研究蛋白质组中功能分类与验证，从而阐明重要现象的分子机制等［27］。蛋白质组学研究的基本步骤包括蛋白质样品制备、分离、鉴定和生物信息学分析。

2.3 蛋白质组学的主要研究进展

蛋白质组学已广泛应用于生物医学、药学、微生物学和农学等研究领域，取得了可喜的进展。通过比较病变组织与正常组织或疾病不同发展阶段的组织中蛋白质的表达差异，寻找与疾病相关的特异蛋白质，为研究疾病的早期诊断、生物标志物、新药靶标和分子发病机制提供线索［28］。Lee I等［29］利用蛋白组学技术研究慢性丙型肝炎，发现补体蛋白过高表达，认为其可作为与该型肝炎相关的特异性蛋白标志物。Huang Z等［30］比较了食管癌及癌旁组织的蛋白质组表达差异，发现在癌组织中磷酸丙糖异构酶、锰超氧化物歧化酶和热休克蛋白表达上调，而鳞状细胞癌抗原、细胞角蛋白和膜联蛋白表达下调，该结果为阐明食管癌的发生机制提供了线索，也为寻找食管癌潜在标志物奠定了理论基础。另外，通过蛋白质组学技术研究药物的毒理作用机制，寻找毒性的蛋白标志物，以此预测或评价药物的毒性，对新药研发和早期预测在的毒性作用具有重要意义。Yamamoto T等［31］用2-DE-MS方法比较了4种肝毒性药物（对乙酰氨基酚、胺碘酮、四环素和四氯化碳）干预后的肝组织蛋白表达谱，发现CA3、HSP60、AK4等8种蛋白在肝损伤组织中均发生改变，发现其蛋白质表达模式的变化与血液生化指标及组织病理等传统的毒性评价结果一致，说明蛋白质组学在药物先导化合物的毒性筛选中具有重要的指导作用。

迄今，国内外学者利用蛋白质组学技术已在白血病、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肾癌和神经母细胞癌等重大疾病研究方面进行了大量的探索，发现了1 500多个潜在的新的疾病蛋白标志物［32］，为肿瘤的发病机理、早期诊断、新药筛选和疗效判定提供了重要物质基础和理论依据。由此可见，蛋白质组学技术已经成为生物医学领域简单、快速、得力的研究工具。

3 蛋白质组学在奶牛蹄叶炎研究中的应用

3.1 蛋白质组学在兽医科研中的应用

虽然蛋白质组学在生命科学研究中取得了可喜的成绩，但在兽医学研究领域应用却是刚刚起步［33］，主要集中在病原与宿主相互作用的机制研究，以期筛选病原的致病或耐药机制相关蛋白和疫苗候选抗原或药物靶标。如卢占军［34］对马立克病病毒（MDV）感染SPF鸡后不同感染阶段的法氏囊组织进行蛋白质组学研究，提出载脂蛋白ApoaI持续的过量表达可能与MDV粒子跨膜感染机制有关，同时以ApoaI过表达为主导的脂类代谢紊乱可能是最终导致MDV感染易引起动脉粥样硬化的主要原因。Sun J F等［35］应用2D-DIGE技术分析猪感染猪瘟病毒强毒后，其血清蛋白质组表达发生变化，发现4种蛋白表达上调，6种蛋白表达下调，功能涉及血管生成、血凝机制和抗炎途径。刘永杰等［36］首次研究了Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异，结果发现感染组细胞蛋白表达上调251个点，下调221个点，新合成蛋白点30个，为揭示该病毒侵入细胞的分子机制提供了线索。杨艳玲等［37］应用蛋白质组学和Western blot方法，筛选羊布鲁菌膜蛋白的候选抗原，发现12种蛋白能够被牛、羊两种血清共同识别，涉及布鲁菌的能量代谢，蛋白合成，脂肪酸代谢及糖和辅酶的合成等生理过程，为研制布鲁菌亚单位疫苗提供了候选抗原。由此可见，将蛋白质组学策略引入兽医科研中，为一些重大复杂疾病的防控研究开辟了新思路，提供了新的线索。

3.2 蛋白质组学在奶牛蹄叶炎研究中的应用

蹄叶炎是奶牛全身代谢紊乱的局部表现［7］，因此，奶牛发生蹄叶炎后，其血浆蛋白组必定发生相应的变化，开展血浆蛋白质组学研究，寻找并鉴定疾病发生过程中差异表达的蛋白质，为发现疾病相关的特异性生物标志物、药物作用靶点和阐明疾病发生机理提供了新思路［38］。Andersson L等［39］研究了74例临床蹄叶炎奶牛血清中蛋白的表达变化，发现γ-球蛋白和α-球蛋白呈现明显的变化。但是，蛋白质组学在奶牛蹄叶炎研究中的应用尚未见报道，笔者在2012年2月25日在PubMed文献资源库中进行了检索，在“题目／摘要”范畴内，以“蛋白质组学”、“蛋白质组学和牛”、“蛋白质组学和蹄叶炎”为检索词，分别检出40724、102、1篇论文，将“蛋白质组学”、“牛”和“蹄叶炎”等主题词联合检索时，其结果为“0”。而在马蹄叶炎的研究上，Johnson P J等［40］为了寻找基质金属蛋白酶MMP对蹄小叶基底膜降解的标志物，发现蹄叶炎马血清中Ⅳ型胶原蛋白含量显著高于健康马。Hannah G H等［41］采用蛋白组学方法研究马蹄叶炎的蹄部组织时，发现37个蛋白表达上调，而22个蛋白表达下调，并且认为差异表达的软骨基质蛋白（COMP）和角蛋白会被进入血液，从而可能作为生物标志物用来判断马蹄叶炎的发展阶段。因此，将蛋白质组学技术应用到奶牛蹄叶炎的研究中，必定也会带来新的发现。

4 展望

近年来，蛋白质组学不论在基础理论还是在技术方法上，都在不断成熟和完善，并与其他学科的交叉合作也日益加强，如蛋白质组学与基因组学、转录组学、代谢组学和生物信息学等领域的结合，呈现出崭新的系统生物学研究模式，其整体性研究为特征的学术思想为研究那些复杂的疾病提供了全新的思路。尽管蛋白质组学还是一门新兴的学科，但随着科学技术日新月异的发展，不断涌现出新的蛋白质分离和鉴定技术，如毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）、二维色谱与质谱联用技术、蛋白质芯片技术等，使之对复杂的蛋白质体系进行高分辨率的分离及高成功率的鉴定成为可能，极大地促进了蛋白质组学的发展及其在其他学科中的应用。如今，蛋白质组学在生物医学研究中已逐步显示出其巨大的应用价值和前景，已经成为人类进行生命科学研究最强有力的手段。

在奶牛蹄叶炎研究中，应用蛋白组学策略研究奶牛血浆或组织中蛋白质组的表达变化，不仅可进一步揭示奶牛蹄叶炎的发生机制，为蹄叶炎的早期防治提供新途径，而且可丰富和补充奶牛蹄叶炎的病因学和发展阶段理论，提高我国奶牛疾病的研究水平。因此，应用蛋白质组学研究奶牛蹄叶炎具有重要的理论意义与实用价值，相信在不久的将来，我们会利用这些先进的学术思想和科学技术，破解奶牛蹄叶炎研究中现存的科学之谜。

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