不同转染条件影响质粒转染效率的探讨

王红钢，林 波，汪文利

（1.河南大学医学院 生物化学与分子生物学教研室，河南 开封 475004；2.河南大学医学院 病理生理学教研室，河南 开封 475004；3.开封市第二人民医院 耳鼻喉科，河南 开封 475000）

不同转染条件影响质粒转染效率的探讨

王红钢1，林 波2，汪文利3

（1.河南大学医学院 生物化学与分子生物学教研室，河南 开封 475004；2.河南大学医学院 病理生理学教研室，河南 开封 475004；3.开封市第二人民医院 耳鼻喉科，河南 开封 475000）

目的通过插入不同片段质粒、不同剂量的转染，研究GFP基因转染效率的变化。方法构建插入不同片段的载体，以不同条件转染HeLa细胞，以Northern blot分别检测转染入细胞中各个质粒的表达水平。结果2.0×105／mL细胞浓度的转染效率高于1.0×105／mL细胞浓度；固定转染质粒和脂质体的比值，转染效率随转染复合物量的上升而增加；固定脂质体的量，C1－ORF2、C1－ORF2as和C1－280－1×14as随转染剂量的增加，转染效率先升高再下降或表现持平。结论转染质粒的种类、剂量及转染细胞浓度影响转染质粒报告基因表达。

转染；质粒；脂质体；Northern blot；GFP

目前，研究基因表达的常用方法是将外源基因转入真核细胞，病毒和非病毒载体是常用的两种载体［1－2］。病毒载体虽然转染效率较高，但其具有公共安全性和较易产生转染细胞毒性等问题［3－4］。非病毒载体免疫性低，能进行多次注射和大批生产，对于临床基因治疗拥有很大的应用潜力。常用的非病毒载体转基因方法有电穿孔法、磷酸钙沉淀法和脂质体法［4－7］。LipofectamineTM2000容易优化和操作，在有血清存在的条件下仍然能保持较高的转染效率和较低的细胞毒性，可用于多种细胞转染。质粒经载体导入细胞之后，其表达还受质粒大小、转入质粒的量、细胞类型、启动子／增强子类型等条件的影响。本研究用不同插入片段的质粒，以不同的质粒量转入HeLa细胞，检测对GFP报告基因表达的影响。

1 资料和方法

1.1 材料

pAlu14质粒为本研究室前期工作构建，系将14个Alu元件同向、正向串连插入pEGFP－C1质粒的GFP基因下游，pEGFP－C1质粒为空载体，不含有插入序列。pEGFP－C1质粒、DH5α菌株和HeLa细胞均为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建 合成22R或其带有突变位点的模板序列，用带有酶切位点引物PCR扩增合成的模板，引入酶切位点。将突变序列插入pEGFPC1质粒，利用XbaⅠ和NheⅠ酶切位点可以用T4 DNA连接酶连接，但是连接以后对2种酶均不敏感的特性，制成带有22R突变序列的2串联质粒，将突变的插入序列切下连入C1－Alu14质粒（pEGFP－C1－Alu14）的GFP基因和Alu串联序列之间，测序正确后用于实验。

1.2.2 细胞培养 HeLa细胞常规培养于含体积分数为10%的灭活新生小牛血清并加入DMEM培养液中（含青霉素100U／mL、链霉素100mg／L），放置于37℃温箱培养。用质量分数为0.25%的胰酶消化，培养瓶温箱培养3d，使细胞处于对数生长期，进行实验。

1.2.3 细胞转染 不同类型和量的质粒（包括重组表达载体和pEGFP－C1）用LipofectamineTM2000（Invitrogen Carlsbad，USA）瞬时转染培养于24孔板的HeLa细胞，于37℃、体积分数5%CO2环境中继续培养36h，用Trizol试剂提取总RNA用于Northern blot检测。

1.2.4 Northern blot检测 用9N随机引物和大肠杆菌DNA聚合酶大片段将α－32P－dCTP掺入DNA（590bp）中制备GFP基因探针。上、下游引物分别为：5′－CTTGTACAGCTCGTCCATGC－3′和5′－CTTGTACAGCTCGTCCATGC－3′。提取转染细胞总RNA，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，将RNA转移到尼龙膜上，与探针杂交后放射自显影。用剥离液处理杂交过的尼龙膜，去除GFP基因探针，用检测Neo RNA探针再次杂交，放射自显影作为转染效率的内参照。Neo探针用随机引物法标记，扩增片段为671bp，上、下 游 引 物 分 别 为：5′－CACAACAGA CAATCGGCTGCT－3′ 和 5′－AGCGGCGATACCG TAAAGCAC－3′。

2 结果

2.1 HeLa细胞浓度对GFP报告基因表达的影响

将HeLa细胞用胰酶消化，用DMEM完全培养基配成1.0×105／mL和2.0×105／mL，加入12孔培养板中，1.0mL／孔，37℃、体积分数5%CO2条件下培养24h，用以下质粒转染：C1－1A×2－Alu14（1A），C1－22R×2－Alu14（22R），C1－Alu14（Alu14），C1－1AMI×2－Alu14（1AMI），C1－4TMI×2Alu14（4TMI），转染量均为0.8μg质粒／4μL脂质体／孔。转染后培养24h或36h，提取RNA做Northern印记检测GFP RNA的表达，结果见图1。1A，22R，Alu14不同的细胞浓度转染后培养24h，结果说明，2.0×105／mL细胞浓度转染效率高于1.0×105／mL细胞浓度（图1泳道1比较泳道2，泳道3比较泳道4，泳道5比较泳道6）。转染后培养36h的结果与培养24h的结果类似（图1泳道7比较泳道8，泳道11比较泳道12，泳道15比较泳道16）。1AMI和4TMI 2个质粒转染后培养36h的结果说明，2.0×105／mL细胞浓度的转染效率高于1.0×105／mL细胞浓度（图1泳道9比较泳道10，泳道13比较泳道14）。

图1 转染细胞浓度对GFP报告基因表达的影响

2.2 质粒转染量对GFP基因表达的影响

用不同量的质粒－脂质体转染复合物（质粒量∶脂质体体积＝1∶2），转染 HeLa细胞（1.8×105细胞／孔）。质粒－脂质体转染复合物的量如下：0.5μg质粒／1.0μL脂质体／50μL，1.0μg质粒／2.0μL脂质体／100μL，2.0μg质粒／4.0μL脂质体／200μL，3.0μg质粒／6.0μL脂质体／300μL。4种质粒的转染效率，均随着质粒－脂质体转染复合物量的上升而上升，结果见图2。图2A是C1－Alu14、C1－7nt×16质粒（本室以往工作构建，AAATAAA反复重复共640bp）的转染结果。图2B是C1－280－1×14、pEGFP－C1质粒的转染结果。

图2 质粒转染量对GFP基因表达的影响

2.3 不同质粒和质粒转染量对GFP基因表达产生影响

对恒定转染复合物的体积，恒定脂质体的量，改变质粒的量对转染效率的影响，本研究用不同质粒做了观察。C1－ORF2，pEGFP－C1，C1－Ag×16（本室以往工作构建，AgAgAgAg反复重复共640bp），C1－PolyAas－Alu14，C1－PolyAas－ORF2，C1－2F2R×64和C1－2A2C×16共7个插入不同DNA片段的质粒，按不同质粒量转染HeLa细胞，结果见图3。质粒的量对转染效率产生影响的总趋势是：转染效率随转染的质粒量的增加而上升，但是，对于不同的质粒上升的幅度不完全一致。pEGFP－C1，C1－2F2R×64和 C1－2A2C×16这3种质粒属于转染量明显影响转染效率的质粒（图3B、F、G）；图3C、D、E是C1－Ag×16，C1－PolyAas－Alu14，C1－PolyAas－ORF23种质粒的转染结果，质粒0.4μg转染与0.8μg质粒转染，GFP基因表达上升不如上述的粒明显；C1－ORF2转染量在0.8μg时GFP基因表达持平或略高于1.2μg（图3A）。

图3 不同质粒和质粒转染量对GFP基因表达产生不同影响

2.4 转染量在不同的质粒影响GFP报告基因表达

图3中C1－ORF2转染量在0.8μg时GFP基因表达持平或略高于1.2μg。为了验证该现象，用C1－ORF2，C1－ORF2as和 C1－Alu143种质粒做类似实验，结果见图4A。C1－ORF2和C1－ORF2as的表现与C1－Alu14不同（泳道1～6比较泳道7～9），C1－Alu14质粒随着转染量的上升，GFP基因表达明显提高，而C1－ORF2和C1－ORF2as质粒的GFP基因表达在0.8μg之后提高不显著甚至有下降的趋势。图4B 用 C1－Alu14as，C1－280－1×14 和 C1－280－1×14as做实验，结果显示，C1－280－1×14as质粒在0.8μg质粒量时，GFP基因表达比0.4μg质粒的GFP基因表达明显升高，但是1.2μg质粒量比0.8μg质粒量的GFP基因表达升高不明显或有下降趋势（图4B泳道7～9）；C1－Alu14as随着质粒量的增加呈持续上升，与图4A中C1－Alu14的结果类似。

图4 转染量在不同的质粒影响GFP报告基因表达

3 讨论

质粒转染量影响其基因表达在国内外均有报道［5－6］。转染时质粒的量影响转染效率，当每孔质粒为0.5μg时，LipofectamineTM2000转染效率最高。质粒与脂质体的比例影响转染效率，DNA和LipofectamineTM2000比例为1∶3时转染效率最高，约72%［7］。

质粒大小也影响其转染效率，将λ噬菌体不同大小的 DNA 片段（0.65、1.20、2.40、2.90、5.00kb）插入pGL3－c质粒的荧光素酶报告基因下游，随着插入片段长度的增加，报告基因表达降低［8］。本研究使用的表达载体为pEGFP－C1，在GFP基因下游插入不同基因片段，用LipofectamineTM2000转染，研究GFP基因表达与上述插入有不同片段质粒转染量的关系。结果表明，质粒转染效率在一定的范围内与其转染量呈正相关，0.4μg的C1－ORF2转染时，GFP基因几乎不表达，当0.8μg转染时，GFP基因表达迅速上升。但是在1.2μg转染时，GFP基因表达反而下降（图 3A），C1－ORF2as（图 4A），C1－280－1×14as（图4B）也有类似表现。

将H2－Kb基因转入到C57小鼠中检测其表达，结果表明，基因表达不与转基因的个数完全呈正比［9］，转入13个基因的小鼠淋巴结表达值为7.2，而转入39个基因的表达仅为3.4。用PAC报告质粒转染时，同时用无关质粒如pUC18进行稀释（相当于减少报告质粒的量），结果显示，在某些稀释倍数时，PAC质粒的表达不下降反而上升［10］，我们也得到了相似结果，为什么出现此现象，还不能很好的解释，是否与等位基因排斥有关，值得进一步研究。

［1］Cavazzana－calvo M，Thrashier A，Mavilio F.The future of gene therapy［J］.Nature，2004，427（6977）：779－781.

［2］Anderson W F.Human gene therapy［J］.Nature，1998，392（6679）：25－30.

［3］Shubiao Z，Yingmei X，Bing W，et al.Cationic compounds used in lipoplexes and polyplexes for gene delivery［J］.Journal of Controlled Release，2004，100（2）：165－180.

［4］Ma B，Zhang S，Jiang H，et al.Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery［J］.J Control Release，2007，123（3）：184－194.

［5］许期年，王秀云，左剑玲，等.3种脂质体介导法转染大鼠小胶质细胞的比较研究［J］.山东医药，2011，51（4）：2119－2122.

［6］Zabner J，Fasbender A J，Moninger T，et al.Cellular andmolecular Barriers to Gene Transfer by a Cationic Lipid［J］.J Biomol Bio，1995，270（32）：18997－19007.

［7］段艳，王冰，崔韶辉，等.阳离子脂质体转染Hela细胞的实验［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13（11）：2119－2122.

［8］Yin W，Xiang P，Li Q.Investigations of the effect of DNA size in transient transfection assay using dual luciferase system ［J］.Analytical Biochemistry，2005，346（2）：289－294.

［9］Hatinaa J，Frangoulisc B，Gregorova S，et al.Lymphoid speci city of a copy number－related expression of the H2－Kb transgene［J］.Molecular Immunology，1999，36（1）：73－80.

［10］Walker W E，Porteous D J，Boyd A C.The effects of plasmid copy number and sequence context upon transfection efficiency［J］.J Control Release，2004，94（1）：245－252.

［责任编辑 时 红］

Study for the influence of different transfected condition on plasmid transfected efficiency

WANG Hong－gang1，LIN Bo2，WANG Wen－li 3（1.Department of Biochemistry and molecular Biology，Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Dept.of Pathology and Pathophysiology，Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；3.Otolaryngological Dept.of Kaifeng Second People Hospital，Kaifeng，Henan 475000，China）

ObjectiveTo study the change of the transfected efferency of GFP gene by transfecting plasmids inserted different segments with different amounts.MethodsThe plasmids inserted different segments were constructed and transfected into HeLa cells with different transfected condition，Northern blot then was used to detect the expression of the transfected plasmids respectively.ResultsThe transfected efficiency of the cell concention of 2.0×105／mL was higher than that of the cell concention of 1.0×105／mL；When the ratio between the plasmid and the lipofectamine was kept constantly，the transfected efficiency increased with the amount of the transfected compound increase.When the amount of lipofectamine was constantly，the transfected efficiency of C1－ORF2，C1－ORF2as，and C1－280－1×14as firstly increased then decreased or kept fair with the transfected amount increased.ConclusionThetype and amount of transfected plasmids and the concentration of transfected cells influenced the expression of transfected plasmids.

Transfection；Plasmid；Lipofectamine；Northern blot；GFP

Q782

A

1672－7606（2012）02－0111－04

2011－12－12

王红钢（1975－），男，河南 开封 人，博士，副教授，从事基因表达调节的研究工作。