抗乳腺小叶增生合剂的质量标准研究

王亚洲，吕建伟（1.广西医科大学第四附属医院，广西 柳州 545005；.广西柳州市中医院，广西 柳州 545001）

抗乳腺小叶增生合剂为广西医科大学第四附属医院院内制剂，处方包括白芍、丹参、甘草、当归、柴胡、郁金、夏枯草、元胡、生牡蛎等数味中药，具有散瘀止血、消肿止痛、活血调经等功效[1]，临床用于治疗妇女乳腺小叶增生，疗效明显[2]，副作用小。原质量标准中只对丹参进行定性鉴别，规定相对密度≥1.02，并无含量测定内容。为进一步提高本制剂质量标准，更好地保证临床疗效，笔者参阅有关文献[3，4]，对处方中的白芍、当归和丹参进行了薄层色谱（TLC）鉴别，并用高效液相色谱（HPLC）法同时测定抗乳腺小叶增生合剂中芍药苷、阿魏酸和甘草酸3种成分的含量。

1 仪器与试药

LC-10ATvp HPLC仪（日本Shimadzu公司）；752紫外分光光度计（南京麒麟分析仪器有限公司）；AB-L电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MP511电子pH计（上海三信仪表厂）；B2500S超声波清洗器（美国Branson公司）。

甘草、柴胡、元胡、生牡蛎药材（柳州市百草堂中药饮片厂，批号分别为110817、110922、110812、110825）；郁金药材（国药控股柳州有限公司，批号:20110914）；夏枯草药材（柳州市神农饮片厂，批号:20110811）；芍药苷、丹参酮ⅡA对照品和白芍、当归、丹参对照药材（中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-200630、110766-200518、 120905-201109、 120927-201014、 120923-200912）；阿魏酸、甘草酸标准品（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为20110406、YY20101107，含量均≥98%）；抗乳腺小叶增生合剂（广西医科大学第四附属医院制剂室自制，批号:110715、110728、110810）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1 白芍的TLC鉴别

取本品10mL，加70%甲醇10mL，超声（功率:120 W，频率:40 kHz）处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2mL使溶解，作为供试品溶液；称取白芍对照药材粉末0.5 g，同法制成对照药材溶液；按处方组成，取除白芍以外的其余药材，按工艺要求制成缺白芍阴性样品，同法制成阴性对照溶液；另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述4种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。白芍的TLC见图1。

2.2 当归的TLC鉴别

取本品10mL，用乙醚振摇提取3次，每次10mL，合并乙醚提取液，挥干，残渣加无水乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；称取当归对照药材粉末0.5 g，同法制成对照药材溶液；按处方组成，取除当归以外的其余药材，按工艺要求制成缺当归阴性样品，同法制成阴性对照溶液；另取阿魏酸标准品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为标准品溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述4种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品溶液色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。当归的TLC见图2。

图1 白芍的TLC1～3.供试品；4.芍药苷对照品；5.对照药材；6.阴性对照Fig 1 TLC of Paeonia lactiflora1～3.test samples；4.paeoniflorin control；5.reference substance；6.negative control

图2 当归的TLC1～3.供试品；4.阿魏酸标准品；5.对照药材；6.阴性对照Fig 2 TLC of Angelica sinensis1～3.test samples；4.ferulic acid standard；5.reference substance；6.negative control

2.3 丹参的TLC鉴别

取本品10mL，加乙醚10mL，振摇，放置1 h后取乙醚液，重复3次上述操作，合并乙醚液，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作为供试品溶液；称取丹参对照药材粉末0.5 g，同法制成对照药材溶液；按处方组成，取除丹参以外的其余药材，按工艺要求制成缺丹参阴性样品，同法制成阴性对照溶液；另取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述4种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯（19∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。丹参的TLC见图3。

图3 丹参的TLC1～3.供试品；4.丹参酮ⅡA对照品；5.对照药材；6.阴性对照Fig 3 TLC of Salvia miltiorrhiza1～3.test samples；4.tanshinoneⅡAcontrol；5.reference substance；6.negative control

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Inertsil C8（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃（18∶80∶2）；检测波长:300 nm；柱温:30℃；流速:1.0mL·min－1；进样量:20μL。在此色谱条件下，芍药苷、阿魏酸和甘草酸的色谱峰均能达到基线分离，其他成分对测定无干扰。芍药苷保留时间约为10.1min，阿魏酸保留时间约为13.5min，甘草酸保留时间约为21.6min。色谱见图4。

3.2 混合对照品溶液的制备

图4 高效液相色谱图A.供试品；B.阴性对照；C.混合对照品；1.芍药苷；2.阿魏酸；3.甘草酸Fig 4 HPLC chromatogramsA.test sample；B.negative control；C.mixed control；1.paeoniflorin；2.ferulic acid；3.glycyrrhizic acid

称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的芍药苷对照品和阿魏酸、甘草酸标准品各适量，精密称定，置于同一棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每1mL分别含芍药苷1038.6μg、阿魏酸86.2μg和甘草酸1265.2μg的混合对照品溶液。

3.3 供试品溶液的制备

精密量取抗乳腺小叶增生合剂10mL，置于100mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备

按照处方组成，取除白芍、当归和甘草以外的其余药材，按工艺要求制成不含芍药苷、阿魏酸和甘草酸的阴性合剂，照“3.3”项下方法制成阴性对照溶液。

3.5 线性关系考察

取上述混合对照品溶液适量，用50%甲醇稀释成6个浓度，即得芍药苷浓度分别为 25.96、51.93、103.86、155.79、207.72、259.65μg·mL－1，阿魏酸浓度分别为2.15、4.31、8.62、12.93、17.24、21.55μg·mL－1，甘草酸浓度分别为31.63、63.26、126.52、189.78、253.04、316.3μg·mL－1的溶液，依次进样，按上述色谱条件测定。再分别以各组分的检测浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得芍药苷、阿魏酸和甘草酸的回归方程分别为Y＝6037X+769（r＝0.9995，n＝6）、Y＝171526X－11067（r＝0.9998，n＝6）、Y＝23752X+2136（r＝0.9996，n＝6）。结果表明，芍药苷、阿魏酸和甘草酸的检测浓度分别在25.96～259.65、2.15～21.55、31.63～316.30μg·mL－1范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

3.6 精密度试验

分别取上述混合对照品溶液1000、500、200μL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，制备成高、中、低浓度的溶液。分别在同日内连续进样5次，计算日内精密度；在5 d内连续进样5次，计算日间精密度。结果，芍药苷、阿魏酸和甘草酸日内精密度的RSD分别为1.74%、1.05%和1.58%（n均为5）；日间精密度的RSD分别为2.76%、2.27%和2.62%（n均为5），表明仪器精密度良好。

3.7 重复性试验

取同一批（批号:110715）抗乳腺小叶增生合剂适量，按“3.3”项下方法平行制成6份供试品溶液，照上述色谱条件测定。结果，芍药苷、阿魏酸和甘草酸的RSD分别为0.92%、1.15%和1.34%（n均为6），表明本方法重复性良好。

3.8 加样回收率试验

取已知含量的同一批（批号:110715）抗乳腺小叶增生合剂适量，共6份，分别置于容量瓶中，再加入一定量的混合对照品溶液，按“3.3”项下方法制成供试品溶液，照上述色谱条件测定，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

3.9 样品含量测定

取3批抗乳腺小叶增生合剂各适量，分别按“3.3”项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定，以外标法计算各组分含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝5）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝5）

4 讨论

本品共含有10味中药，试验选择其中3味进行了TLC鉴别，其余药味由于在试验过程中发现干扰大、重复性较差等因素，故暂不纳入标准。

采用HPLC法同时测定制剂中几种组分的含量时，选择合适的检测波长尤为关键。笔者对芍药苷、阿魏酸和甘草酸的对照品溶液分别进行全波长紫外扫描，确定芍药苷最大吸收波长为230 nm，阿魏酸最大吸收波长为316 nm，甘草酸最大吸收波长为250 nm。在上述色谱条件下，分别于230、250、300、316、350 nm等波长处对供试品溶液进行分析，发现阿魏酸最大吸收波长316 nm附近的300 nm处所得的HPLC图谱上各组分峰分离效果较好，杂质干扰峰亦被消除，且能较好地兼顾含量较小的阿魏酸的峰形，因此选择300 nm作为检测波长。

参考有关文献[5，6]，经过对不同流动相的摸索，发现乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃（18∶80∶2）为流动相时，3组分的出峰时间更合适，峰形好、无拖尾，且不受杂质峰干扰。在流动相中加入少量的四氢呋喃，很好的改善了峰形。但四氢呋喃容易与流动相中的溶解氧形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260 nm波长以下），导致检测灵敏度的轻微降低[7]，所以试验流动相必须预先彻底脱气。四氢呋喃易被氧化从而可能在色谱图中产生倒峰，故添加四氢呋喃的流动相宜现用现配。

本品中白芍、当归、甘草等均为主要药味，方法学研究结果证明，采用TLC法对上述3味药材进行定性鉴别，色谱斑点清晰、专属性强。本试验建立的以HPLC法同时测定芍药苷、阿魏酸和甘草酸含量的方法灵敏度高、专属性好，为其他制剂同时测定上述3种组分提供了方法参考。相比于文献[8]中的调pH值后再用乙醚萃取的方法，本试验中仅需对合剂稀释即可进行含量测定，操作简便易行。对3批样品分别进行分析，测定结果准确、重复性好，说明笔者建立的质量标准可用于抗乳腺小叶增生合剂的质量控制。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:附录34、80-81、96-97、124-125.

[2]肖 萍，陈少卿.抗乳腺小叶增生合剂的制备与临床应用[J].中国药师，2008，11（6）:727.

[3]王亚洲.高效液相色谱法测定抗乳腺小叶增生合剂中丹参酮ⅡA的含量[J].现代医药卫生，2011，27（19）:2887.

[4]黄安军，聂晓玲.HPLC法同时测定乳核内消液中芍药苷和阿魏酸的含量[J].西北药学杂志，2009，24（6）:436.

[5]杨忠兰，石尚友.RP-HPLC法测定血府逐瘀口服液中芍药苷的含量[J].中国药房，2008，19（21）:1648.

[6]李 丽，师永清.HPLC法测定加味藿香正气丸中甘草酸的含量[J].中国药房，2007，18（33）:2605.

[7]张庆合.高效液相色谱实用手册[M].北京:化学工业出版社，2008:83.

[8]李锦燊，吴洪文.高效液相色谱法测定抗乳腺小叶增生合剂中延胡索乙素的含量[J].海峡药学，2009，21（4）:51.