灵芝多糖抑制NADPH氧化酶表达防治大鼠动脉粥样硬化

吴 锋，孟国梁，常珊珊，徐济良

(南通大学医学院药理学教研室，江苏南通 226001)

灵芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide，GLP)为多孔菌科真菌灵芝［Ganoderma lucidum(Leys.Ex Fr.)Karst］中提取出的以 β(1→3)糖苷键为主链的杂多糖［1］。笔者证实GLP可有效通过调节脂质代谢紊乱减缓大鼠动脉粥样硬化(AS)病程［2］，杨丽娟等［3］发现灵芝多糖肽对人脐静脉内皮有抗氧化损伤作用，而氧化应激在AS发生发展过程中为主因之一［4］;所以本实验以AS大鼠为实验模型，观察GLP能否通过干预AS氧化应激过程起到治疗作用，并探讨其作用机制，为临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1药品与试剂GLP(江苏安惠生物科技有限公司，含量82%)，胆固醇(上海蓝季科技发展有限公司)，胆酸钠(上海蓝季科技发展有限公司)，丙基硫氧嘧啶(上海复星朝晖药业有限公司)，维生素D3(上海通用药业股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(南京建成生物工程公司)，活体组织氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒(genmed)，兔抗大鼠Nox4多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，兔抗大鼠p22phox多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2模型制作健康♂SD大鼠40只，体质量180～200 g，南通大学实验动物中心提供。随机分为5组:正常对照组(CON)、AS模型组(AS)、GLP低、中、高剂量预防组(GLPL、GLPM、GLPH)。除正常组外其余4组以40 mg·kg－1剂量一次性腹腔注射维生素D3，喂高脂饲料(81.3%基础饲料、10%猪油、3%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶)。造模同时，GLP低、中、高剂量组每日分别以 GLP 125、250、500 mg·kg－1灌胃，正常组和模型对照组给予等量生理盐水灌胃。

1.3方法

1.3.1血清MDA、SOD检测实验12周后大鼠禁食12 h，20%乌拉糖腹腔麻醉，颈动脉插管取血，2 000 r·min－1分离血清，使用测试盒分别测定血清MDA、SOD含量。

1.3.2主动脉HE染色取大动脉(从主动脉弓至腹主动脉分叉处)，以生理盐水冲洗残血，用4%多聚甲醛溶液固定，逐级乙醇脱水，石蜡包埋切片，HE染色观察主动脉内膜情况。

1.3.3主动脉ROS测定手术取出血管，用刀片切碎组织，使用genmed活体组织氧化应激活性氧(ROS)初级荧光测定试剂盒，在激发波长490 nm，散发波长520 nm下使用荧光酶标仪检测。

1.3.4免疫印迹Nox4、p22phox蛋白表达从主动脉弓至腹主动脉分叉处取主动脉，加入含有蛋白酶抑制剂的组织裂解液冰上提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电流100 V;300 mA转膜150 min;含5%脱脂奶粉TBST室温封闭1 h;分别加Nox4和p22phox一抗4℃过夜;d 2加相应的二抗室温反应1 h，扫膜并使用imageJ进行灰度分析。

1.4统计学处理利用SPSS11.5统计软件分析处理数据，计量资料用±s表示，组间采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。

2 结果

2.1大鼠血清MDA、SOD变化与CON组比较，AS组 MDA、SOD明显升高(P＜0.01)，给药组MDA、SOD较AS组均明显下降(P＜0.01)，Tab 1。

Tab 1 Comparison of MDA，SOD levels of serum in rats of each group after 12 weeks’administration(±s，n=8)

Tab 1 Comparison of MDA，SOD levels of serum in rats of each group after 12 weeks’administration(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs AS

Group MDA/μmol·L－1 SOD/NU·ml －1 CON 6.2 ±1.0## 160.23 ±32.58##AS 10.3 ±2.1* 206.01 ±39.34＊＊GLPL 8.7 ±0.9*## 178.04 ±15.23*##GLPM 7.1 ±1.2*## 170.85 ±23.07*##GLPH 7.3 ±1.6*## 174.57 ±33.78*##

2.2大鼠动脉粥样斑块改变如Fig 1所示，正常对照组大鼠胸、腹主动脉壁结构完整，层次清晰，内膜连续而光滑，中层平滑肌层均匀无萎缩;动脉粥样硬化模型组血管壁内皮脱落，内膜增厚，内皮下间隙增宽，内弹力板断裂，斑块内含有大量泡沫细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞，纤维组织增生伴片状钙化，中膜平滑肌明显萎缩;GLP预防组内皮细胞部分脱落，结构较完整，有少量脂质沉积，少见内弹力板断裂。

Fig 1 HE staining of aorta(×400)

2.3主动脉ROS含量变化如Fig 2所示，AS组大鼠主动脉ROS含量明显增高;与AS组比较，GLP各给药组主动脉ROS含量均明显下降(P＜0.01)。

2.4主动脉Nox4、p22phox表达变化如Fig 3免疫印迹结果显示，AS组Nox4、p22phox蛋白表达量均较CON组增高(P＜0.01)，GLP干预后目的蛋白表达量明显下降(P＜0.01)。

Fig 2 Ratio of aorta ROS’s optical density(±s，n=8)

Fig 3 Westen blot of vascular Nox4 and p22phox in rats of each group(±s，n=3)

3 讨论

食饵性实验AS动物模型通常用于模拟AS早期病变，病变首先呈现于主动脉［5］，实验大鼠12周后形态学检测大鼠主动脉显示AS模型成立。血清中氧化应激指标MDA水平AS组较CON组明显增高，MDA是ROS攻击细胞膜多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，间接反映ROS的生成量和对组织损伤的程度［6］;结合主动脉ROS试剂盒检测，均提示AS状态下机体可能存在抗氧化防御机制的下降和体内ROS生成的增多。灵芝多糖药理学研究证实具有多种生物活性和药理作用，除了主要的免疫调节和抗肿瘤作用外，Zhao等［7］报道GLP可以通过抑制氧化应激减少大鼠皮层原代神经元缺氧/复氧损伤，杨丽娟等［3］也发现灵芝多糖肽对人脐静脉内皮有抗氧化损伤作用，我们证实GLP具备减缓大鼠氧化应激反应阻遏主动脉粥样硬化病程进展的作用。

目前认为SOD是体内有效清除ROS的天然抗氧化酶［8］，实验发现AS模型组SOD血清含量较正常组明显上调，可解释为病程中ROS增多后抗氧化酶的合成分泌在一定时程内代偿性增加，但实验中提示这一代偿机制不足以消除体内积聚的过多ROS。GLP能够有效降低主动脉ROS水平和血清MDA值，说明GLP可能是通过减少ROS的生成途径阻遏动脉粥样硬化病程。

NADPH氧化酶目前被认为是血管内生成ROS的主要酶体，NADPH氧化酶参与了AS的发生和发展全过程［9］。NADPH氧化酶，包含胞膜成分细胞色素b558(gp91phox和p22phox)和胞质成分p47phox、p67phox及小的 GTP结合蛋白 rac等5个亚组分［10］，其中p22phox在各种细胞中都高表达。近年来至少发现了两种新的gp91phox同工酶家族即Nox和 DUOX，Nox家族有 Nox1、Nox2(gp91phox)、Nox3、Nox4、Nox5等成员;在血管细胞中，内皮细胞和平滑肌细胞主要表达 Nox1和 Nox4。Sorescu等［11］发现在动脉粥样硬化患者体内，冠脉斑块肩部存在大量过氧化物沉积，同时增高的 p22phox和 Nox2(gp91phox)结合后主要位于斑块中的巨噬细胞，Nox4定位于血管平滑肌和内皮细胞。血管生理学认为，Nox家族是血管ROS的主要来源，并且血管平滑肌的NADPH氧化酶活性主要依赖于Nox4的表达［12－13］。血管平滑肌的分化表型在动脉粥样硬化病理过程中起关键作用，Clempus等［14］Nox家族中只有Nox4在血管平滑机分化过程中起决定作用。我们实验发现GLP药物干预能够有效下调主动脉p22phox和Nox4蛋白表达，这可能是GLP能够下调AS大鼠主动脉ROS水平，起到防治动脉粥样硬化作用的主要原因，但详细机制有待进一步研究。

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