四氢小檗红碱及其前药的比格犬药代动力学研究

彭真珍，原 梅，温 泉，李 桦，赵春杰，杨 征

(1.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850;2.沈阳药科大学，辽宁沈阳 110016;3.军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)

焦虑症(anxiety disorder)是一种以持续性的焦虑、紧张或反复性发作的惊恐不安等情绪为主的神经症，主要表现为病人充满了长久的(持续在6个月以上)、过度的、模糊的、不明原因的焦虑和担心，并伴有自主神经紊乱、肌肉紧张及运动不安等症状。近年来随着经济发展、生活节奏加快和社会竞争的激烈，焦虑症患者的发病率呈现上升趋势。抗焦虑药(anxiolytics)是主要用以减轻焦虑、紧张、恐惧、稳定情绪，兼有镇静催眠作用的药物。应用抗焦虑药是临床上治疗焦虑症的重要方法，目前常用的抗焦虑药主要有苯二氮艹卓类药物、5-HT1A部分激动剂、选择性5-HT再摄取抑制剂以及其他新型抗焦虑药等［1－2］。此外，长期应用某些抗抑郁药也能起到抗焦虑作用，如阿米替林和文拉法辛等。但是，这些药物在临床应用中均存在诸如作用广泛、不良反应较多、起效缓慢等问题。因此，研究药效好、副作用低的抗焦虑药物依然是社会公共心理卫生的迫切需求，已成为神经系统药物的研发热点。

四氢小檗红碱(THB)是小檗碱的衍生物之一，代号为BJ236-1。前期药理学研究发现，THB具有较好的抗焦虑效应，且无中枢兴奋或抑制作用［3］，因此有望成为抗焦虑的候选药物。但由于THB的水溶性较差，口服生物利用度很低，不利于开发成为口服药物。为了改善THB的成药性，通过生物转化的方法在THB的9位羟基上乙酰化得到其前药9-乙酰四氢小檗红碱硫酸盐(ATHBS)。早期药代性质评价结果显示，与THB相比，ATHBS在动物体内的吸收明显改善，前药在体内能很快释放出活性成分THB，明显提高了THB口服生物利用度，这些特点表明ATHBS是具有一定开发前景的药物候选物。为了评价THB及其前药的体内处置和药代动力学性质，本文首次建立了同时检测比格犬全血中ATHBS及THB浓度的LC-MS/MS方法，并研究了比格犬口服和静注ATHBS后前药和THB的药代动力学及口服生物利用度，为ATHBS的进一步开发和临床研究提供必要的实验依据。

1 材料与方法

1.1药品和试剂THB(Fig 1)和ATHBS标准品，纯度＞99%，由军事医学科学院基础医学研究所提供(中国药科大学中药学院中药复方研究室合成)。盐酸小檗碱(BR)，纯度＞98%，购自中检所;乙腈(色谱纯)为Fisher公司产品，甲酸、甲酸铵和氢氧化钠均为分析纯。

Fig 1 Chemical structure of THB

1.2仪器Agilent UHPLC 1290液相色谱系统，包括二元输液泵(G4220A)、自动进样器(G4226A)、柱温箱(G1316C)。Agilent 6410三重四级杆串联质谱，配备电喷雾离子源(ESI)以及数据采集软件MassHunter B.04.00。高速低温离心机(美国Thermo公司)。

1.3比格犬药代动力学试验健康♂比格犬5只，体质量为(10±2)kg，由军事医学科学院动物中心提供，动物许可证号SCXK-(军)2007-004。动物随机编号并称重，采用双周期自身交叉实验设计，按3 mg·kg－1剂量给药。比格犬口服给药前12h禁食，自由饮水。ATHBS给药溶液用生理盐水配制，口服组以1 ml·kg－1的体积灌胃;静注组以 0.5 ml·kg－1的体积前肢静注给药。口服组于给药前和给药后5、10、15、30 min、1、2、4、6、8、12 和 24 h 采血约200 μl，静注组于给药前和给药后 2、5、15、30 min、1、2、4、6、8、12 和 24 h 采血约 200 μl。两组试验之间净化期为7 d。

1.4LC-MS/MS分析条件取比格犬新鲜全血100 μl，立即加入到提前放置于冰浴的 400 μl乙腈中(含100 μg·L－1内标)，涡旋60 s，4℃，18 800 ×g离心10 min，取上清液400 μl于－20℃冻存待测。样品测定前再次4℃、18 800×g离心10 min。色谱柱为 Eclipse Plus C18柱(4.6 mm ×100 mm，3.5 μm，Agilent，USA);流动相为水(含0.1%甲酸，5 mmol·L－1甲酸铵)-乙腈(含0.1%甲酸);梯度洗脱程序为0～2 min 35%B，2～3 min 90%B，3～3.5 min 90%B，3.5～4 min 35%B，4～5 min 35%B;流速为0.6 ml·min－1;柱温 30 ℃;进样体积 2 μl;总洗脱时间为5 min。质谱条件:离子源为ESI，正离子模式检测;多反应监测(MRM)扫描方式定量;毛细管电压3 800 V;源温度为350℃;雾化气(NEB)为40 psi;用于定量分析的离子对分别为:ATHBS m/z 368→ m/z 176.1，THB m/z 326→ m/z 176.1 和 BR m/z 336.3→ m/z 320.1。

1.5方法学验证用采自6条犬的混合空白犬血90 μl加入10 μl系列浓度的ATHBS和THB 混合工作液，配制浓度范围为 2 ～2 000 μg·L－1的标准曲线样品，按“1.4”描述的方法处理样品并测定，得到方法的线性范围和最低定量限。另配制浓度为5、100、1 500 μg·L－1的 ATHBS 和 THB 的混合质控样品各5份，连续3 d，每日测定5次，用随行标准曲线计算相应的药物浓度，分别计算批内和批间的精密度与准确度。在3个质控浓度水平，以全血加标样品的峰面积与标准溶液的峰面积之比，计算方法的回收率。另取空白血样按“1.4”描述的方法处理，得到提取后的空白样品，以提取后空白加标样品的峰面积与流动相加标样品的峰面积之比，计算基质效应。在低、中和高3个质控浓度水平，考察了ATHBS和THB的处理样品在4℃放置24 h，冰浴放置2 h以及－20℃放置不同天数的稳定性。

1.6数据统计分析THB的血药浓度－时间曲线用WinNonlin软件(Version 5.2.1，美国)的非房室模型进行拟合，得到药代动力学参数。Cmax为实测的最大血药浓度，Tmax为口服给药后血药浓度达峰时间为药物末端消除半衰期，MRT为药物在体内平均滞留时间，血药浓度－时间曲线下面积AUC(0-t)由梯形法计算得到，Vd为稳态时表观分布容积，CL为清除率。绝对生物利用度计算公式如下:

2 结果

2.1LC-MS/MS定量方法学验证本研究全面考察了LC-MS/MS同时定量检测犬血中THB和ATHBS的方法学。Fig 2是空白、空白加标和实际血样的MRM色谱图，血样中的内源性物质不干扰待测物和内标的测定，THB、ATHBS和内标的保留时间分别为2.52、3.07和3.90 min。THB和 ATHBS的标曲在2～2 000 μg·L－1的范围内呈良好的线性关系(r＞0.9985)，二者的定量下限均为 2 μg·L－1。THB和ATHBS低、中和高3个浓度的回收率分别大于78.74%和75.52%;全血基质对THB和ATHBS测定的影响很小，二者的基质效应分别在94.59%～98.91%和100.81%～108.85%的范围内。THB和ATHBS的日内和日间精密度(RSD)分别＜10.79%和＜6.57%，准确度(RE)在－10.30%～3.92%的范围内，符合新药临床前药代动力学研究生物样品定量分析的要求，结果分别见Tab 1，2。在现行条件下，THB和ATHBS的低、中和高3个浓度在全血前处理样品中4℃放置24 h，冰浴放置2 h以及－20℃放置27 d的稳定性也符合要求，实测浓度与配制浓度之间的相对误差(RE)分别＜11.68%和11.13%。上述结果表明，本文建立的同时定量测定犬血中THB和ATHBS的LC-MS/MS方法的专一性、重现性和灵敏度均符合临床前药代动力学样品分析的要求，可以用于比格犬药代动力学研究。

Tab 1 Intra-and inter-day precisions and accuracies of THB in dog blood(±s)

Tab 1 Intra-and inter-day precisions and accuracies of THB in dog blood(±s)

Nominal Conc/μg·L －1 Inter-day(n=5)Measured Conc/μg·L －1RSD/% RE/%Intra-day(n=15)Measured Conc/μg·L－1RSD/% RE/%5 4.48 ±0.18 3.91 －10.30 5.06 ±0.55 10.79 1.26 100 102.10 ±0.82 0.80 2.10 101.78 ±7.43 7.30 1.78 1500 1 558.80 ±22.34 1.43 3.92 1 511.86 ±59.52 3.94 0.79

Tab 2 Intra-and inter-day precisions and accuracies of ATHBS in dog blood(±s)

Tab 2 Intra-and inter-day precisions and accuracies of ATHBS in dog blood(±s)

Nominal Conc/μg·L －1 Inter-day(n=5)Measured Conc/μg·L －1RSD/% RE/%Intra-day(n=15)Measured Conc/μg·L－1RSD/% RE/%5 4.79 ±0.11 2.38 －4.26 4.90 ±0.32 6.57 －1.93 100 101.00 ±1.37 1.35 1.00 101.50 ±4.42 4.36 1.50 1 500 1 543.05 ±26.48 1.72 2.87 1 511.76 ±41.50 2.75 0.78

Fig 2 Representative MRM chromatograms of(A)blank blood sample，(B)blank sample spiked with THB，ATHBS and IS，(C)Beagle dog blood sample collected at 10 min after oral administration of 3 mg·kg－1ATHBS

2.2比格犬静注和口服药代动力学采用双周期自身交叉实验设计研究了比格犬静注和口服ATHBS(3 mg·kg－1)后全血中前药和THB的药代动力学和口服生物利用度。比格犬静注ATHBS后2 min时的平均血浓度为(144.17±39.30)μg·L－1，随之血中浓度快速下降，所有受试犬给药1 h后ATHBS血浓度均低于检测限。口服给药后5～30 min，ATHBS的血浓度波动很大，犬之间的个体差异也较大，30 min后大多数比格犬ATHBS的血浓度低于检测限。静注和口服后均未能得到完整的ATHBS药代动力学曲线。

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of THB in Beagle dogs after oral or intravenous administration of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of THB in Beagle dogs after oral or intravenous administration of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

Parameter Unit iv Oral T 7.03 ±1.77 5.89 ±3.95 AUC(0-t) μg·h·L－1 718.64 ±143.01 179.62 ±91.64 AUC(0-∞) μg·h·L－1 778.57 ±162.73 203.95 ±97.10 Tmax h － 0.23 ±0.04 Cmax μg·L－1 605.99 ±102.88 77.71 ±26.60 Vd L·kg－1 39.15 ±5.07 －CL ml·min－1·kg－166.65 ±14.81 －MRT(0-t) h 4.26 ±1.40 5.62 ±1.88 F 12 h%26.2

Fig 3 Mean blood concentration-time profiles of THB in Beagle dogs after oral and intravenous administrations of 3 mg·kg－1ATHBS(±s，n=5)

比格犬静注和口服ATHBS后活性成分THB的平均血药浓度－时间曲线见Fig 3。以非房室模型进行拟合得到的主要药代动力学参数，见Tab 3。比格犬口服和静注ATHBS后在血中可迅速转化成活性代谢产物THB，静注组的THB血药浓度在第1个采样点(2 min)即达到(605.99±102.88)μg·L－1的峰值，随后血药浓度呈双相下降，平均消除半衰期为7.03h。口服组的THB血药浓度出现双峰现象，第1个峰值出现在 15min左右，Cmax的均值为(77.71±26.60)μg·L－1，第2 个小峰出现在给药后6 h，平均血药浓度为(16.43±15.05)μg·L－1。随后血药浓度的下降与静注组相似，平均消除半衰期为5.89 h，与静注组相比差异无显著性。以比格犬血中的THB暴露(AUC)计算得到口服给药的绝对生物利用度为26.2%。

3 讨论

本研究首次建立了同时测定比格犬全血中ATHBS和THB的LC-MS/MS方法，该方法专属性强，灵敏度高，可同时定量分析前药和活性代谢产物。此方法不仅已用于比格犬药代动力学的研究，也易于推广至其它临床前动物或人体试验。在方法建立初期发现，ATHBS结构中含有酯键，易被血浆中的酯酶水解，在全血和血浆中极不稳定。如果按照常规方法分离血浆或取全血后批次处理血样本，ATHBS在处理过程中就会部分发生降解，生成THB，因而不能准确反映前药和活性产物在生物体内的实际浓度。经反复实验，最终确定采集全血后立即加入预先冰冷的乙腈，终止酯酶水解反应并沉淀蛋白，随后低温离心分离以阻止全血中酯酶对药物的进一步转化作用。方法学验证的结果表明，前处理方法简便可行，解决了前药在试管中可能转化为活性产物、导致血药浓度检测出现假象的问题。

比格犬单次静注和口服给予ATHBS后，在全血中能迅速转化成活性代谢产物THB。口服组THB达峰迅速，体内吸收过程近似于静脉给药，但整体血药浓度低于静注组，这可能与口服组的THB在经ATHBS转化的同时在体内经历进一步的肝肠代谢有关。体外研究结果表明，THB在肝微粒体中能较快代谢转化，形成其它氧化代谢产物(未发表结果)。静注组前药的血药浓度很快降至定量检测限之下，而THB的血药浓度在首个采样点即达到峰值，几乎没有滞后期，表明前药的体内行为符合设计要求，明显改善了活性成分的吸收，THB是血循环中的主要成份并发挥药理作用。THB的静注清除率(CL)为(66.65 ±14.81)ml·min－1·kg－1，远远高于比格犬的肝脏血浆流量(30 ml·min－1·kg－1)［4］，提示其体内首过效应较强。稳态分布容积(Vd)为(39.15 ±5.07)L·kg－1，远远高于比格犬的全身水含量(0.6 L·kg－1)［4］，提示药物有广泛的血管外组织分布。虽然口服前药后THB的血药浓度在比格犬体内消除较快，但其口服生物利用度为26.2%，与THB直接给药相比有明显提高。

口服ATHBS后THB在体内也较快达峰，并在6h左右二次达峰，而静脉注射未见此现象。文献报道，口服小檗碱不仅能对抗和抑制感染，而且还发现其具有阻断胃肠道平滑肌α受体的作用，从而减慢胃肠道蠕动［5］。此外，小檗碱的药代动力学研究结果表明，动物和人口服小檗碱后均出现双峰现象［6－7］，因此小檗碱及其衍生物THB对胃肠道蠕动的减慢是可能造成双峰或多峰现象的原因之一［8］，可考虑在后期研究中同时给予咖啡因等促进肠道蠕动的药物，观察对THB双峰现象的影响。

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