通心络超微粉对缺血性脑卒中大鼠微血管新生影响的实验研究

常丽萍，张秋燕，韩建科，魏 聪，贾振华，3

(1.河北以岭医药研究院，国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，2.河北省络病重点实验室，河北石家庄 050035;3.国家中医药管理局中医络病学重点学科，河北石家庄 050091)

脑血管病已成为危害我国中老年人身体健康的主要疾病。最近调查数据显示，在脑血管病患者中缺血性脑卒中占68%［1］。因此，提高缺血性脑卒中的治愈率，降低致残率，已成为当前一项刻不容缓的重要任务。脑缺血发生后机体通过增加受损区的氧供代偿这种破坏性的影响，其中一种重要的机制就是诱导血管新生，但机体的这种反应尚不足以改善脑缺血后的神经功能康复。中医药在促进脑缺血后微血管新生方面具有优势，可弥补这种不足，促进脑缺血后血管生成，从而有利于神经功能的恢复。

1 材料与方法

1.1实验动物健康SPF级♂ SD大鼠48只，体质量110～140 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号:SCXK(京)2006-2009。饲养在河北以岭医药研究院药理实验室，光照12 h/d，温度20℃ ～23℃，相对湿度40% ～60%。

1.2药物和试剂通心络(Tongxinluo，TXL)超微粉(由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成的棕褐色粉末)，0.076 g(生药)/kg体质量，由石家庄以岭药业股份有限公司提供，批号20090430);尼莫地平(拜耳医药保健公司提供，批号H20003010);NO试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20100519);VEGF ELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司，批号Z1ZFBZAA02);CD31羊抗鼠多克隆抗体(美国Santa Cruz公司提供，批号sc-1506)。

1.3主要仪器SANYO超低温冰箱(日本三洋公司);SZ-PT解剖显微镜(日本OLYMPUS公司);DT-2000电子天平(美国双杰兄弟(集团)有限公司);XD711酶标仪(上海迅达医疗器械公司)。

1.4模型制作参照文献［2］，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，侧卧位，于左侧眼眶后至耳的中点纵形切开皮肤1.5 cm左右，沿颞骨缘剪开颞肌筋膜，完全暴露颞骨的颞鳞和蝶骨大翼，在颧弓上方颞鳞与蝶骨大翼交界处钻孔，用血管钳向下方咬骨做3～5mm骨窗，切开硬膜可见横过嗅束向上行走的大脑中动脉，用11/0号手术线结扎大脑中动脉中段。假手术组大鼠只挑开脑膜，不结扎血管，于手术创面撒少许青霉素药粉，随后分层缝合肌肉和皮肤，单笼饲养。

1.5动物分组及给药参照Bederson等［3］方法稍加改进，对大鼠神经功能障碍程度进行评分:0分，无任何神经功能丧失;1分，右前肢不能充分伸展;2分，提尾时向右环形或旋转运动;3分，向右转圈，成追尾状或向右倾倒;4分，不能自然行走或无自发活动意识障碍者。神经功能障碍评分为1～3分的大鼠进行随机分组，其余予以剔除。分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、通心络大剂量组(TXLH)、中剂量组(TXL-M)、小剂量组(TXL-L)、尼莫地平组(Nim)。其中假手术组和模型组以等体积的生理盐水灌胃，通心络大、中、小剂量组相当于临床用量的16、8、4 倍，分别以 1.6、0.8、0.4 g·kg－1·d－1灌胃，即 2.4、1.2、0.6 g(生药)·kg－1·d－1灌胃，尼莫地平组以10 mg·kg－1·d－1，1 次/d 灌胃。各组于给药14 d后每组处死8只动物进行检测。

Fig 1 Effects of Tongxinluo on microvascular density CD31in cerebral cortex ischemia area(×400)

1.6观察指标及检测方法

1.6.1大脑皮层微血管密度观察大鼠心脏灌注固定后立即取脑，置于4%多聚甲醛固定48h后，石蜡包埋，于视交叉前缘开始作8 μm厚冠状切片。SP法CD31免疫组化染色，DAB显色。

1.6.2血管新生相关因子检测

1.6.2.1血清 NO、VEGF检测 常规分离血清，ELISA放射免疫方法检测VEGF含量;硝酸还原酶法检测NO。实验操作步骤严格按照说明书进行。

1.6.2.2脑组织中VEGF表达的检测 大鼠心脏灌注固定后立即取脑，置于4%多聚甲醛固定48h后，石蜡包埋，于视交叉前缘开始作8 μm厚冠状切片。SP法VEGF免疫组化染色，DAB显色。

1.7统计学处理采用SPSS17.0统计软件，进行正态性检验，如正态分布数据用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，若方差齐，两两比较采用最小显著差法(least significant difference，LSD)，若方差不齐则采用Dunnett's T3检验行两两比较;如不符合正态分布，则用非参数检验进行统计，所有数据均用±s表示。

2 结果

2.1通心络对脑缺血大鼠皮层微血管密度的影响

CD31蛋白阳性表现为棕黄色染色，主要在大脑缺血皮层区内皮细胞、单核细胞及神经胶质细胞表达。正常脑组织中有少数散在分布，模型组蛋白表达增强，通心络大、中剂量组、尼莫地平组CD31蛋白阳性分布密集且着色明显，均强于模型组，其中以通心络大剂量组为优。结果见Fig 1。

2.2血清NO，VEGF水平检测结果与模型组比较，通心络大剂量组、通心络中剂量组大鼠血清NO水平明显提高(P＜0.05，P＜0.01)，且通心络大剂量组优于通心络中剂量组(P＜0.05);通心络大剂量组与通心络小剂量组、尼莫地平组比较NO水平明显提高(P＜0.01)。与模型组比较，通心络大剂量组大鼠血清VEGF水平明显提高(P＜0.01)，通心络大剂量组优于通心络小剂量组和尼莫地平组(P＜0.05，P＜0.01)。结果见 Tab 1。

2.3脑组织VEGF蛋白表达结果VEGF蛋白在脑组织皮层区神经元、血管内皮细胞、神经胶质细胞均阳性表达。正常脑组织仅有少量表达，与模型组相比，通心络大剂量组表达明显加强，其余各用药组虽然表达有所加强，但差异无显著性。结果见Fig 2。

Fig 2 Effects of Tongxinluo on protein expression of VEGF in cerebral cortex ischemia area(×400)

Tab 1 NO/VEGF content of ischemic stroke rats in serum(±s，n=6)

Tab 1 NO/VEGF content of ischemic stroke rats in serum(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs TXL-L group;◆◆P ＜0.01 vs Nim group;△P ＜0.05 vs TXL-M group

Group NO/μmol·L －1 VEGF/ng·L －1 Sham 23.21 ±3.24 12.91 ±1.77 Model 21.24 ±3.93 14.22 ±1.00 TXL-H 48.07 ±4.20＊＊△##◆◆ 26.23 ±4.80＊＊#◆◆TXL-M 35.57 ±1.70* 19.73 ±1.75 TXL-L 29.76 ±3.41 16.95 ±0.98 Nim 27.70 ±3.21 13.60 ±1.63

3 讨论

有研究表明，脑梗死患者脑组织中血管新生从梗死后3～4 d开始［4］，新形成的血管明显改善缺血区血流灌注，促进脑缺血后的神经功能恢复［5－6］，这说明促进缺血区微血管新生对保护神经元具有重要作用，血管新生为脑梗死的治疗开辟了一条再血管化的新途径。

目前发现血管新生相关因子很多，其中包括VEGF、NO等成血管因子。VEGF是内皮细胞特异性的促有丝分裂原和趋化因子，通过促进内皮细胞增殖，加速新生血管的形成。NO是众多血管生长因子的下游介质，两者相互协调，共同作用。最近Babaei等［7］研究表明来自内皮的NO是Ang-1诱导血管生成所必需的，通过NO/cGMP路径起作用。NO能够延长内皮细胞生命周期，增强内皮细胞的增殖和迁移力，具有调节血管生成因子，刺激血管生成的作用。存在于脑组织中的NO、VEGF一旦受到缺血、缺氧或炎症等刺激，开始大量合成并释放入血，故血清NO、VEGF含量可以有效反映脑组织中NO、VEGF的合成状态。应用络病理论指导血管病变防治研究研制出的创新药物通心络胶囊［8－13］可以保护脑组织毛细血管内皮细胞，促进缺血性脑卒中毛细血管新生，改善脑微小循环障碍，减轻脑水肿，缩小脑梗死面积，改善神经功能缺损，抑制其凋亡，初步显示出具有促进治疗性血管新生的作用。本研究结果显示通心络能够增加毛细血管密度，升高血清NO，VEGF水平，促进脑组织中VEGF表达，以上结果提示通心络可能通过上调缺血脑组织中血管生长因子NO、VEGF表达，从而促进脑微血管新生，改善神经功能恢复。

［1］饶宜光，池洪珊，黄文繁，等.深圳市社区人群脑卒中发病类型的分布特征［J］.现代预防医学，2007，34(9):1611 －2.

［1］Yi X G，Chi H S，Guang W F，et al.Distribution characteristics of stroke types in urban area in Shenzhen City［J］.Modern Preventive Med，2007，34(9):1611－2.

［2］Majid A，He Y Y，Gidday J M，et al.Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains editorial comment［J］.Stroke，2000，31(11):2707 －14.

［3］Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472 －6.

［4］Szpak G M，Lechowicz W，Lewandowska E，et al.Border zone neovascularization in cerebral ischemic infarct［J］.Folia Neuropathol，1999，37(4):264 －8.

［5］Zhang Z G，Zhang L，Jiang Q，et al.VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain［J］.J Clin Invest，2000，106(7):829 －38.

［6］Wei L，Erinjeri J P，Rovainen C M，et al.Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke［J］.Srtoke，2001，32(9):2179－84.

［7］Babaei S，Kuliszewka K T，Zhang Q，et al.Angiogenic actions of angiopoietin-1 require endothelium-derived nitric oxide［J］.Am J Pathol，2003，162(6):1972 －36.

［8］赵永厚，唐燕红，闻 名，等.通心络对大鼠急性缺血性卒中脑微小循环障碍的影响［J］.上海中医药大学学报，2006，20(3):37－9.

［8］Zhao Y H，Tang Y H，Wen M，et al.Effect of Tongxinluo on cerebral microcirculation disturbance in acute ischemic stroke rats［J］.Acta Univ Tradit Med Sin Pharmacol Shanghai，2006，20(3):37－9.

［9］曾丽莉，沈帆霞，陈生弟，等.通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响［J］.中药药理与临床，2007，23(4):40－2.

［9］Zeng L L，Shen F X，Chen S D，et al.Effect of Tongxinluo on reperfusion injury cell apoptosis in cerebral ischemia rats［J］.Pharmacol Clini Chin Mat Med，2007，23(4):40－2.

［10］吕 昀，李学玲，李文战，等.通心络对脑梗死大鼠的神经保护作用［J］.中国实用神经疾病杂志，2009，12(15):37－8.

［10］Lü Y，Li X L，Li W Z，et al.Protective effects of Tongxinluo on neurological fanction in cerebral rats infarction［J］.Chin J Practical Nervous Dis，2009，12(15):37 －8.

［11］梅爱农，王 珏，湛彦强，等.通心络胶囊对脑梗死大鼠脑皮质血管新生和皮层神经元凋亡的影响［J］.实用医学杂志，2006，22(3):267－70.

［11］Mei A N，Wang J，Zhan Y Q，et al.Effect of Tongxinluo Capsule on cerebral infarction rat with cerebral cortex angiogenesis and cortical neurons apoptosis［J］.J Practical Med，2006，22(3):267－70.

［12］董为伟，石正洪.通心络促脑缺血后血管内皮生长因子表达的实验研究［N］.中国医学论坛报，2003:13－4.

［12］Dong W W，Shi Z H.Experimental study on vascular endothelial growth factor expression of Tongxinluo after cerebral ischemia［N］.China Med Trib，2003:13 －4.

［13］张志慧，吴以岭.通心络对Aβ1-42损伤人脑微血管内皮细胞HIF-1α、VEGF 表达的干预作用［J］.中国药理学通报，2010，26(1):124－7.

［13］Zhang Z H，Wu Y L.Regulating effect of Tongxinluo on HIF-1α，VEGF generated by the human brain microvascular endothelial cells induced by β-amyloid1-42［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):124－7.