金胺O荧光染色在石蜡组织切片麻风病诊断中的应用

齐兴峰 谢飞来 朱育连 郑智勇

（南京军区福州总医院病理科，福建 350025）

目前病理学诊断麻风病主要依靠HE染色形态特点和抗酸染色找到麻风杆菌作为确诊依据［1］。抗酸染色法作为经典的麻风杆菌检测方法，一直以来都被各级医院应用。瘤型麻风病变中麻风杆菌很容易被抗酸染色显示，但在结核型或未定型麻风病变中杆菌数量非常少，可能会出现阴性染色；或仅有极少量杆菌，需要镜检者花较长时间仔细寻找才能查到一根抗酸杆菌［2］。采用PCR检测麻风杆菌是目前比较先进的方法，但由于麻风病例数量少，一般医院都没有备有相应的检测试剂。

金胺O荧光染色原理与抗酸染色相似，临床上主要用于痰液或分泌物中结核杆菌的检测［3］。我们曾证实金胺O荧光染色可以用于石蜡切片检测结核杆菌以及非结核分支杆菌［4］，且效果优于抗酸染色。本文将进一步观察金胺O荧光法用于石蜡切片中麻风杆菌的染色效果。

材料和方法

1 标本

选取我科存档的麻风病组织蜡块6例，其中瘤型麻风5例，未定型麻风1例；男性4例，女性2例，年龄34岁－72岁，中位年龄53岁。另取异物性肉芽肿6例作为阴性对照。每例组织连续石蜡切片4μm厚，分别做金胺O荧光染色和抗酸染色。

2 金胺O荧光染色

染色剂：金胺O粉剂0.1g溶于10ml 95%乙醇中，加5%石碳酸至100ml；脱色剂：3%盐酸－75%乙醇；复染剂：0.5%高锰酸钾水溶液。步骤：切片脱蜡至水，浸入预热的染色剂中63℃染色15－25min，水洗，脱色剂脱色2－5min至无黄色，水洗，复染剂复染30s－2min，水洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；荧光镜检。

3 抗酸染色

染色剂：碱性复红8g溶于95%乙醇10ml中，加5%石碳酸900ml，放置24h后过滤备用；脱色剂：5%盐酸－75%乙醇；复染剂：0.15g溶入50ml 95%乙醇中，加蒸馏水至1000ml。步骤：切片脱蜡至水，浸入预热的染色剂中63℃染色25－35min，水洗，脱色剂脱色2－5min至无红色，水洗，复染剂复染1－3min，水洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；光镜镜检。

4 阳性定量

400 倍视野巡视整个组织切面，未发现抗酸杆菌为阴性；发现麻风杆菌后，在杆菌阳性处看5个视野：＜10条抗酸杆菌/视野为弱阳性（＋）；＞10～100条/视野为中阳性（＋＋）；＞100条/视野为强阳性（＋＋＋）。

结 果

6例麻风病组织蜡块金胺O荧光染色和抗酸染色均显示麻风杆菌阳性（附表）。例3瘤型麻风金胺O染色除了皮肤真皮肉芽肿组织中有大量麻风杆菌外，在表皮内也可以见到少量单根散在的麻风杆菌；连续切片的抗酸染色片皮肤真皮肉芽肿组织中有大量麻风杆菌，但未能见到表皮层内单根散在麻风杆菌（图1，2）；例6未定型麻风肉芽肿组织中仅有少量单根散在的麻风杆菌。金胺O荧光染色片在荧光镜下麻风杆菌呈明亮淡绿色细长杆状、略为弯曲的发光体，因背景暗色对比清晰（图3）；抗酸染色片麻风杆菌呈红色细杆状，背景对比不如金胺O染色清晰（图4）。6例异物肉芽肿金胺O荧光染色和抗酸染色均为阴性。

表1 金胺O荧光和抗酸染色结果Table1 The results of acid－fast stain and auramine O fluorescent stain

图1 金胺O染色片显示表皮内单根散在的麻风杆菌，真皮浅层散在一些麻风杆菌（×400）；Fig 1.Auramine O fluorescent stain showed scattered M.Leprae in the epidermis layer and the upper dermis（×400）；

图2 与图1同一部位连续切片的抗酸染色片，表皮内未见单根散在的麻风杆菌，真皮浅层散在一些麻风杆菌（×400）；Fig 2.Acid－fast stain of serial section on the same site of the case in the figure 1，was not observed in the epidermis layer，but some scattered M.Leprae was in the upper dermis（×400）；

图3 金胺O染色片荧光镜暗背景下显示大量麻风杆菌团，不易分辨菌体结构，但其间散在的单根麻风杆菌形态清晰，呈细杆状，轻度弯曲（×1000）；Fig 3.Auramine O fluorescent stained section under the darkfiled of fluoroscope showed a large number of M.leprae，and it was difficult to distinguish the structure of of the bacteria，however，the structure of the scattered M.Leprae can be seen clearly，which is thin rod，and bend slightly（×1000）；

图4.与图3同一部位连续切片的抗酸染色片，显示大量麻风杆菌团和单根散在的麻风杆菌（×1000）。Fig 4.Acid－fast stain of serial section on the same site of the case in the figure 3，showed a large number of M.leprae colony and scattered M.Leprae（×1000）.

讨 论

长期以来，国内外医学界都将抗酸染色作为显示麻风杆菌的法定检测方法。然而这一做法有一定局限性，主要是在麻风杆菌稀少的结核型或未定型麻风病组织中，采用抗酸染色有时候会得到阴性结果，有时需要付出长时间耐心的镜检观察才能发现极少量的麻风杆菌［2，5］。这些情况都有可能导致麻风病的漏诊。

金胺O荧光染色法和抗酸染色的原理相同，都是利用了抗酸杆菌菌壁脂质的嗜酸性，在染色剂中加入了石炭酸作为媒染剂，来显示麻风杆菌。国外已有将金胺O染色用于麻风杆菌的组织切片和组织液涂片检查的报道［6，7］，但国内尚未见这方面的报道。我们曾在文献中报道金胺O染色可以代替抗酸染色用于显示结核杆菌和非结核性分支杆菌，其优点是阳性率明显高于抗酸染色［4］。

本文采用金胺O荧光染色对6例麻风病石蜡组织切片进行染色，并与抗酸染色结果相比较。结果显示，两种方法均可以显示麻风杆菌。由于病例数量受限，不能对这两种方法在阳性率方面进行比较。对比镜检效果，荧光镜检由于背景为暗视野，亮绿色荧光的麻风杆菌在镜下十分清晰，400倍视野下即可轻易找到散在的单根麻风杆菌；抗酸染色片在光镜下观察，少量单根的麻风杆菌需要在油镜下（1000倍视野）仔细寻找方能找到。在观察有大量麻风杆菌的标本时，荧光镜检并不占优势；但观察极少量麻风杆菌的标本时，荧光镜检具有找菌时间短，不易视觉疲劳等优点。

例3瘤型麻风的金胺O染色片除了在肉芽肿组织中见到大量麻风杆菌外，皮肤表皮棘层内及角化层下也可以看到少量单根麻风杆菌，连续切片的抗酸染色片中未见此现象；三次重复染色均为此结果，提示金胺O染色显示少量单根散在的麻风杆菌的效果优于抗酸染色。少数瘤型麻风表皮内有少量麻风杆菌这一现象印度学者和日本学者均有过报道［8，9］。这一现象提示少数瘤型麻风患者可以通过无破损的皮肤排出麻风杆菌，这对了解麻风杆菌的传染途径有一定意义。

需要注意的是，金胺O荧光染色存在一定的假阳性。这是由于在切片、染色等过程中污染的杂质经过金胺O荧光染色后会发出与麻风杆菌相同的淡绿色荧光，镜检医生容易把淡绿色荧光的杂质当成麻风杆菌。为了避免假阳性，在400倍视野下发现疑似麻风杆菌后，应转到1000倍视野下进一步辨认确定。

总之，本文证实金胺O荧光染色法可以应用于石蜡组织切片麻风杆菌的检测，而且对于显示少量单根散在的麻风杆菌效果优于抗酸染色。两种方法联合应用可以提高麻风病理诊断的准确性和敏感性。

［1］娄永新，王金良.实用临床细菌学检验与进展.天津：天津科学翻译出版公司，1993.94－95

［2］Bhatia AS，Katoch K，Narayanan RB，et al.Clinical and histopathological correlation in the classification of leprosy.Int J Lepr Other Mycobact Dis，1993，61：433－438

［3］杨虹，苏琪.金胺“O”－罗丹明（B）法与萋尼法在抗酸杆菌涂片镜检中的比较.现代检验医学杂志，2007，3：106－107

［4］齐兴峰，曾德华，郑智勇.金胺O荧光染色和抗酸染色在组织切片结核病诊断中联合应用.临床与实验病理学，2010，31（6）：61

［5］曹萍.长期误诊的麻风病一例.皮肤病与性病杂志，2009，31（4）：61

［6］Bhatia VN，Rao S，Saraswathi G.Auramine staining in histopathology sections.Indian J Lepr，1987，59（4）：386－389

［7］Bramhne HG，Porichha D，Samal RC.Non acid－fast fluorescent M.leprae in skin smears from leprosy patients.Indian J Lepr，1993，65（4）：439－442

［8］Satapathy J，Kar BR，Job CK.Presence of Mycobacterium leprae in epidermal cells of lepromatous skin and its significance.Indian J Dermatol Venereol Leprol，2005，71（4）：267－269

［9］Hosokawa A.A clinical and bacteriological examination of Mycobacterium leprae in the epidermis and cutaneous appendages of patients with multibacillary leprosy.J Dermatol，1999，26（8）：479－488