同型半胱氨酸引起平滑肌细胞LDLR启动子区DNA甲基化改变的位点分析

杨安宁，王 菊，杨晓玲，马长剑，孙炜炜，马胜超，王 磊，徐 华，姜怡邓

(宁夏医科大学1.基础医学院2.检验学院，宁夏银川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的独立危险因素［1］。前期研究发现:Hcy可引起低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)等AS相关基因发生甲基化改变［2］，但Hcy引起DNA甲基化的效应偏重于CpG二核苷酸序列还是CpG岛，即其甲基化作用位点尚不清楚。因此，本文以LDLR为研究对象，探讨Hcy引起平滑肌细胞LDLR发生甲基化改变的具体特点及机制，为进一步研究Hcy引起AS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器和试剂 SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);全自动立式压力蒸汽灭菌器(上海申安YXQ-LS50A);高速低温离心机(Beckmancomlter AvantiJ-301，德国);相差显微镜(日本Nikon公司);凝胶成像系统和酶标仪(Biorad公司，美国);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);CO2培养箱(Heraeus，德国);DNA甲基化修饰试剂盒(Epigentek，美国);DNA提取试剂盒(promega);胰蛋白酶和同型半胱氨酸(Sigma);限制性内切酶HpaII和BssHII(Fermentas);引物由上海生工公司合成。

1.2 人脐静脉VSMCs培养、鉴定及分组 按照Hua等［3］报道的方法，用组织块贴壁培养原代血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecells，VMSCs)。选用第3代细胞用不同浓度 Hcy(50、100、200、500 μmol·L-1)刺激72 h，并以不加Hcy组为空白对照组(control)，进行后续实验。

1.3 巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)法检测LDLR甲基化改变 按DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA。用亚硫酸盐修饰法对其进行修饰。采用在线软件http://www.urogene.org/methprimer/设计引物，LDLR外引物:上游:5'-TTTGGGTAATTAGATGTGGATTTATG-3'，下 游:5'-ACAAAAAAACACTCCCTCTAAAAAA-3'，产 物 长 度412 bp。甲基化引物:上游:5'-TTTAGTAGTTGGA ATTGTAGGTATGC-3'，下游:5'-ACTTTAAAAAATA AACGAA-3'，产物长度151 bp;非甲基化引物:上游:5'-AGTAGTGGAATTGTAGGTATGTGT-3'，下 游:5'-CACTTTAAAAAACAAAAATAAACAAA-3'，产物长度149 bp。程序:94℃预变性5 min，然后进行降落式PCR，每循环降低 0.5℃，30 个循环(94℃，30 s;62℃，30 s;72℃，1 min)，72℃延伸7 min。……