慢性吗啡处理对C6细胞EAAT3蛋白表达的影响及其机制研究

吴 强，何惠燕，傅艳妮，刘 玲，曹铭辉

(中山大学孙逸仙纪念医院1.麻醉科、2.消毒供应中心，广东广州 510120)

吗啡依赖的机制非常复杂，关联到许多调控因素，其中谷氨酸能神经递质系统发挥了重要作用［1］。细胞外液缺乏谷氨酸(glutamate，Glu)失活的水解酶系统，神经末梢释放的谷氨酸需要神经元和胶质细胞上的谷氨酸转运体重摄取至胞内，从而消除谷氨酸能的信号传递作用。兴奋性氨基酸转运蛋白3(excitatory amino-acid transporter 3，EAAT3)是神经元特异性的，在调控Glu摄取速度及Glu受体的功能、调节γ-氨基丁酸(GABA)的浓度、保护神经元方面均发挥重要作用［2－3］。我们前期的研究发现吗啡精神依赖及复吸大鼠前额叶皮层EAAT3蛋白表达水平下降［4］，但其机制未明。本研究使用C6细胞体外模拟吗啡成瘾、戒断、复吸过程，探讨吗啡暴露对C6细胞EAAT3蛋白表达水平的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料试剂 大鼠C6胶质瘤细胞株(购于中山大学动物中心);盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药公司，批号:000355);多克隆兔抗EAAT3(Alpha Diagnostic International，USA);β-actin 抗体(Amersham，Sweden);HRP标记山羊抗兔IgG二抗(Amersham，Sweden);HRP标记的羊抗小鼠二抗(Amersham，Sweden)。

1.2 细胞培养 使用含10%新生牛血清和100 KU·L－1青－链霉素的DMEM培养液培养C6细胞，置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中培养。分组后，分别按每孔2 ml、108个·L－1细胞浓度，种于6孔板上。分别加入不同浓度的吗啡处理细胞，使得C6细胞在提取蛋白前，细胞间有80% ～100%融合。

1.3 实验步骤 ① 培养好的C6细胞分为5组:Control、0.01、0.1、1 、10 μmol·L－1组，分别使用0、0.01、0.1、1、10 μmol·L－1吗啡作用48 h，Western blot检测EAAT3蛋白表达水平，选择对EAAT3蛋白表达影响最明显的浓度用于下一步的细胞复吸模型。② 将 C6细胞分为 4组:Control、24、48、96 h组，各组……