柯萨奇病毒B组3型亚单位疫苗与基因靶向疫苗免疫小鼠的效果比较①

高志云 蓝佳明 金玉怀 李 剑 刘贵霞 羡 仙 张永红 王永祥

(河北医科大学病原生物学教研室，石家庄050017)

柯萨奇病毒 B组 3型(Coxsackievirus B3，CVB3)感染所致的病毒性心肌炎严重危害人类健康。自病原体确立以来，已开展大量疫苗研发工作，但并没有获得满意的进展。研究显示，CVB3衣壳蛋白1(Capsid protein1，VP1)是其主要的中和抗原，可诱导机体产生保护性免疫应答。

本室前期构建了原核表达质粒pET-his/VP1，证实表达VP1蛋白，并且将分泌型CVB3 VP1的基因和三拷贝C3d分子的基因拼接，构建成靶向B细胞的融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1和rAd/C3d3-sVP1［1，2］。为筛选较好的候选疫苗，本研究将VP1蛋白、pcDNA3/C3d3-sVP1和 rAd/C3d3-sVP1分别免疫小鼠，通过观察不同疫苗诱导的特异性免疫应答水平，以及病毒攻击后的免疫保护作用来评价疫苗的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 细胞、菌株和病毒株 人宫颈癌细胞系(He-La)细胞，本室保存;人胚肾293(HEK293)细胞购自中国医学科学院基础所细胞中心;大肠杆菌E.coli DH5α 和 BL21(DE3)pLysS，CVB3 Nancy株，本室保存。

1.2 质粒、重组腺病毒及实验动物 原核表达质粒pET-his/VP1、真核表达质粒pcDNA3/C3d3-sVP1和重组腺病毒rAd/C3d3-sVP1，本室前期构建。6～8周龄雄性纯系BALB/c小鼠购自河北医科大学实验动物中心。

1.3 试剂 各种工具酶购自美国Promega公司;腺病毒沉淀法纯化试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司;细胞计数试剂盒CCK-8购自日本同仁化学研究所。抗His单克隆抗体(mAb)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉公司。其他试剂购自国内外生物公司。

1.4 质粒的大量提取与纯化 将pcDNA3/C3d3-sVP1转化感受态大肠杆菌DH5α，然后接种至2YT液体培养基(含氨苄青霉素)，于37℃振荡培养过夜，收集菌体，按碱裂解法大量制备质粒，并用PEG法对之进行纯化，定量后保存于-70℃备用。……