抑制c-FLIPL表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞的研究①

谭 岩 刘 磊 方艳秋 蒋永兴 (吉林省人民医院医学诊治实验中心，长春130021)

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是一种天然的杀伤肿瘤细胞因子，能强烈诱导肿瘤细胞的凋亡。我们研究证实rhTRAIL蛋白可以诱导非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)H460wt细胞株发生细胞凋亡，但A549细胞株表现出对rhTRAIL蛋白的耐药现象，限制了TRAIL分子在临床研究中的广泛应用［1］。FADD类白介素1转化酶抑制蛋白(FADD like interleukin-1 converting enzyme inhibitory protein c-FLIP)是一类高度保守的凋亡抑制基因，因与caspase-8含有相同死亡效应器结构域，从而参与抑制了TRAIL激活的凋亡信号途经。c-FLIP表达两种蛋白产物，55 kD的c-FLIPL(长链)和28 kD的c-FLIPS(短链)。c-FLIPL被证实是影响TRAIL诱导凋亡敏感性的重要因素［2，3］。抑制c-FLIPL的蛋白表达和/或活性可能是重新激活TRAIL诱导NSCLC细胞凋亡的重要方法。本文以A549细胞株为研究对象，分别选用c-FLIPL活性化学抑制剂他莫昔芬和c-FLIPL基因特异性siRNA靶向作用于cFLIPL，探讨抑制c-FLIPL活性增强rhTRAIL蛋白诱导NSCLC细胞凋亡的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人非小细胞肺癌细胞株A549株由本实验室传代保存。rhTRAIL蛋白由本研究室表达、纯化［1］。IMDM培养基、胰蛋白酶(Gibco公司)小牛血清(杭州四季青生物材料公司)。总RNA提取TRIZOL试剂盒、转染试剂脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);RT-PCR相关试剂(Promega公司);c-FLIPL和β-actin引物(北京鼎国合成);他莫昔芬Tamoxifen(Sigma公司);鼠抗人anti-caspase-8、鼠抗人 anti-cFLIPL、兔抗人 β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma)生物素标记的马抗小鼠IgG及辣根过氧化物酶标记的亲和素(购自北京晶美公司)。

1.2 c-FLIPL靶向RNAi表达载体的构建 构建含有c-FLIPL的 siRNA序列表达载体 pslincer3.1/c-FLIPL。将 A549细胞接种于 6孔板，重组质粒pslincer3.1/c-FLIPL、pslincer3.1/NC(阴性对照)、未转染组细胞以脂质体Lipofectamine2000辅助转染A549细胞(质粒∶脂质体=1∶3)，各设3复孔。……