乙肝清热解毒片等中成药微生物限度检查方法研究

黄 英

（云南省丽江市食品药品检验所，云南 丽江 674100）

根据《中国药典》2010年版规定，在进行药品微生物限度检查时，应对所用方法进行验证，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查［1］。有些中成药含有较强的抑菌成分，由于抑菌成分的干扰，采用常规法进行微生物限度检查，其结果不能真实反映其污染的微生物的状况。为使检测结果科学、准确，检测前应进行方法学验证。本文通过对乙肝清热解毒片等中成药进行方法学验证试验，结果表明：对具有抑菌作用的中成药，其抑菌作用的强弱不同，进行微生物限度检查时，要消除其抑菌活性所采用的方法也不同。

1 试验材料

1.1 菌种 枯草杆菌［CMCC（B）63501］、金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］均由云南省食品药品检验所提供。

1.2 培养基 营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、改良马丁、改良马丁琼脂，MUG、麦康凯琼脂、胆盐乳糖、乳糖胆盐发酵培养基为北京三药科技开发公司和北京牛牛基因技术有限公司生产。按规定进行培养基的适用性检查为合格。稀释剂为pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液。

1.3 样品 乙肝清热解毒片等中成药共12个品种见表1。

2 方法与结果

按《中国药典》2010年版微生物限度检查法［1］进行验证。

2.1 菌液制备

2.1.1 取经30～35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10－5～10－7，使成50～100cfu·mL－1，经活菌计数后备用。

2.1.2 取经23～28℃ 培养24～48h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10－5～10－6，使成50～100cfu·mL－1，经活菌计数后备用。

2.1.3 取经23～28℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，用5mL含0.05%（mL／mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸出孢子悬液1mL至无菌试管内，用含0.05%（mL／mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

2.2 供试液制备 称样品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，得1∶10供试液。

2.3 验证试验 细菌、霉菌与酵母菌计数方法的验证，进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。若试验组的菌回收率均不低于70%，可按该供试液制备方法和计数方法测定供试品的细菌、霉菌与酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用稀释法、薄膜过滤法等消除供试品的抑菌活性，并重新验证。

2.3.1 平皿菌落计数法（常规法） 取供试液（1∶10）1mL入皿，然后每皿加营养琼脂或玫瑰红钠琼脂培养基15～20mL，摇匀，按《中国药典》2010年版附录微生物限度检验方法进行。各试验菌回收率结果见表1。

2.3.2 培养基稀释法 取上述供试液（1∶10）1mL，注入5个平皿中（每平皿0.2mL），然后每皿加营养琼脂培养基15～20mL，摇匀，按《中国药典》2010年版附录微生物限度检验方法进行。各试验菌回收率结果见表2。

2.3.3 薄膜过滤法 取上述供试液（1∶10）1mL，加入置有100mL冲洗液的滤器中，经减压抽滤干净后，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗，每次约100mL，共冲洗400mL／膜，在最后1次冲洗液中加入50～100cfu。滤干后取膜，菌面向上贴于营养琼脂平板，经35℃培养3d后，点计菌落数。各试验菌回收率结果见表2。

表1 乙肝清热解毒片等中成药常规法（1mL／皿）各试验菌回收率（%）

表2 培养基稀释法（0.2mL／皿）和薄膜过滤法回收率（%）

2.4 控制菌检查验证试验 试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌株，加入相应规定量的培养基中，按各控制菌检查法检查。样品组：取规定量供试液，加入相应规定量的培养基中，按各控制菌检查法检查。

3 结果分析

3.1 结果表明 乙肝清热解毒片等中成药对5株阳性代表菌有不同程度的抑菌活性。如乙肝清热解毒片对大场埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉无抑菌作用，如常规法（1mL／皿）试验菌回收率大场埃希菌分别为78%、85%、77%。对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑菌作用，而且乙肝清热解毒片对枯草芽孢杆菌的抑菌作用比对金黄色葡萄球菌的抑菌作用强。

3.2 表1所见，珍菊降压片、保儿宁颗粒、伤痛宁片、天麻头风灵胶囊 、养血安神片对5种阳性对照菌的回收率均高于70%，无抑菌作用，因此平皿菌落计数法（常规法）可用于此5种中成药的微生物限度检查。益脉康胶囊、清肺抑火胶囊、乙肝清热解毒片、平肝疏络丸、清开灵滴丸、丹参益心片、同仁牛黄清心丸对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用，回收率均低于70% 。

3.3 表1所述中成药，对大肠埃希菌、霉菌和酵母菌无抑菌作用，回收率高于70%，因此平皿菌落计数法（常规法）可用于上述12种中成药的大肠埃希菌、霉菌和酵母菌的计数检查。

3.4 表2所见：经培养基稀释（每平皿0.2mL），益脉康胶囊、清肺抑火胶囊、乙肝清热解毒片、平肝疏络丸已无明显抑菌能力，回收率均高于70%，表明培养基稀释法（0.2mL／皿）可用于上述4种中成药的微生物限度检查。清开灵滴丸、丹参益心片、同仁牛黄清心丸常规法和培养基稀释法（0.2mL／皿）检验时对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有很强的抑菌作用，回收率低于70%，采用薄膜过滤法，回收率均大于70%，因此，薄膜过滤法可用于清开灵滴丸、丹参益心片、同仁牛黄清心丸的微生物限度检查。

3.5 控制菌检查结果 试验组检出试验菌，样品组未检出控制菌。各必检控制菌均可用常规法检查。

4 讨论

4.1 选择适当的检查方法，可提高微生物检出率。对无抑菌作用的中成药，用常规法进行药品的微生物限度检查，对于抑菌作用较强的中成药，用培养基稀释法简便有效，对于抑菌作用很强的中成药，用稀释法难以消除供试品的抑菌作用，可选用薄膜过滤法或是几种方法联用消除其抑菌活性，使检查结果更真实反映药品的污染情况。

4.2 乙肝清热解毒片等上述12种中成药进行细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证时，试验菌株仅选用金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌2株菌即可，这样即可保证检验方法的有效性，又节省了大量的人力和物力。

［1］中华人民共和国，中国药典［S］.北京：化工出版社，2010.79～88.