哺乳类动物胃肠道内味觉受体的信号研究

陈晓慧，张春雷，陈 宏＊，2，房兴堂

（1.江苏师范大学细胞与分子生物学研究所，江苏 徐州221116；2.西北农林科技大学动物科技学院/陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西 杨凌712100）

胃肠道是腔内营养或非营养的化学物质、微生物、药物、毒素等各种信号分子的感觉器官。我们通常以胃肠细胞来检测腔内的物质是如何启动激素和神经系统的信号通路，最终达到调控营养物质的消化和吸收，食物的摄取量，胰岛素的分泌及新陈代谢等一系列机能反应。到目前为止，有关于胃肠腔内不同化学成分的分子识别机制还没做过完整的阐述。在此，我们就来阐述口腔内味觉识别的分子信号通路和胃肠细胞的化学感应机制。这些新的研究结果可以为临床医疗和动物的饲养管理提供参考，特别是由腔内的化学敏感引起的食欲不振和代谢紊乱疾病。

1 胃肠道内味觉受体基因家族的表达

我们已经知道，苦味受体基因家族taste receptor，type2（T2Rs）在人和啮齿类动物的口腔味蕾受体细胞中表达［1－3］。这些味觉受体属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族，是由一条多肽形成的7次跨膜螺旋结构，有3个胞内环和3个胞外环。味觉受体第一 家 族 taste receptor，type1，［T1Rs（T1R1、T1R2、T1R3）］也属于G蛋白偶联受体超家族，它们是甜味剂和 L－氨基酸的受体［4，5］。小鼠和大鼠的taste receptor，type2（T2Rs）基因家族由36个完整的基因和至少7个假基因组成，它们分别位于小鼠的2、6、15号染色体上，大鼠的2、3、4号染色体上［6］。人类的T2R基因家族由33个成员组成，至少24个基因编码，分布在第5、7、12号染色体上［7］，揭示在不同的动物中，T2Rs位于不同的染色体上。T2Rs各成员之间仅有30%～70%序列相似度。虽然它们的序列相似度较低，但在第1～3、第7跨膜区和第2胞内区具有高度保守的序列［2］。T2R基因家族各成员在不同物种中的序列相似度更低，对小鼠和人的T2Rs的研究发现，在位于第5跨膜区且靠近第3胞内区的1个氨基酸残基是完全保守的［8］。进一步的研究发现，T2Rs结构中，跨膜区保守性最高，其次是胞内区，而胞外区的变异性最高，所以我们推断胞内区和其临近的跨膜区是与G蛋白相互作用的位点，胞外区是与苦味物质结合的区域［2，9，10］。这一基于序列的推断被后来的功能实验所验证。

我们从小鼠、大鼠的肝脏、心脏、肾脏、脑组织和IEC－6/IEC－8细胞系中提取的 RNA，经过实时定量PCR检测后发现，T2Rs在这些组织中均未表达，但在胃肠道粘膜中均表达［11］。最新的研究发现，在人的结肠中表达 T2Rs，包括 T2R3、T2R4、T2R5、T2R10、T2R13、T2R38、T2R39、T2R40、T2R42、T2R43、T2R44、T2R45、T2R46、T2R47、T2R49、T2R50、T2R60［12］。目前，hT2Rs有些受体的配基已经被鉴别出来了，比如，denatonium benzoate偶联在hT2R47位点上，士的宁偶联在hT2R10位点上，水杨苷偶联在hT2R16位点上［13］，其他苦味物质的偶联位点仍需进一步探究。小鼠、大鼠和人肠道内的T1R1、T1R3以异源二聚体的形式识别L－氨基酸，T1R2、T1R3以异源二聚体的形式识别甜味物质［14－16］。这些研究结果都证明了，甜味、苦味、L－氨基酸受体在小鼠、大鼠和人的肠道内均表达。

2 小鼠、大鼠和人胃肠道细胞中α－味导素Ga和转导素Gat－2的表达

基因学和生物化学方面的证据表明，G蛋白的α亚基即α－味导素Ga对T1Rs、T2Rs的信号识别起着重要作用［17］。除了舌上皮组织外，Ga在胃［11，18］、肠［11，19］、胰腺细胞［11，20］中也有表达，表明味觉感 受机制也存在于胃肠道内。通过原位杂交方法确认，编码Ga的mRNA存在于小鼠和大鼠整个胃肠系统的粘膜中［11，16，21］。

与味觉信号转导有关的转导素Gat－2在胃肠粘膜中表达［6，11］。啮齿类动物胃肠粘膜转导素 Gat－2阳性细胞的分布和形态与Ga的阳性细胞不同［11］，表明Ga和转导素Gat－2也许在小鼠和大鼠胃肠道不同类型的上皮细胞中表达［6，11］。

3 胃肠道内分泌细胞Ga的表达

Ga－gust免疫反应性细胞存在于人胃肠道的各个细胞，同时，我们还得知，Ga在肠内分泌细胞中表达，在其他的肠上皮组织中不表达，说明了Ga－gust是在人胃肠道的内分泌细胞中挥作用［12，16，22］。胃肠道的内分泌细胞占肠上皮组织的量不到1%，但是它们组成了人体最大的内分泌器官，产生和分泌多种激素［23］。开放型的肠内分泌细胞对腔内信号分子的识别是通过基底侧胃肠激素的分泌来完成的。比如，胃肠内分泌L细胞，多位于小肠和结肠处，产生和分泌肠肽激素PYY、胰高血糖素GLP－1。对Ga阳性细胞进行免疫反应性，发现也存在PYY和GLP－1。PYY 和 GLP－1 可 以 调 节 食 物 的 摄 取量［24，27］。除此之外，我们还检测到 Ga与胆囊收缩素CCK共定位于胃肠内分泌I细胞中，CCK可以调节胃肠的蠕动和食物的摄取量。后来的研究同样也证实了，Ga与GLP－1、抑胃多肽GIP共定位于小鼠和人的十二指肠内分泌L细胞中［28，29］。

4 肠内分泌细胞系中与味觉识别有关的因子的表达

培养的细胞系已经广泛地应用于研究肠细胞的功能、信号通路。通过RT－PCR和序列分析，证明了在肠内分泌细胞系STC－1中表达T2Rs、Ga－gust、磷脂酶Cβ2（PLCβ2）、瞬时受体电位 M5（TRPM5），这些信号转导分子都与舌上皮细胞的味觉感知有关［6，11，30］。最近的研究表明，小鼠的肠内分泌细胞系GLU Tag也表达特异性味觉信号因子［16］，大鼠的胰腺肿瘤细胞系 AR42J中也表达T2Rs、Gagust、Gat－2［6］。因此，小鼠的肠内分泌细胞系STC－1、GLU Tag、大鼠的胰腺肿瘤细胞系AR42J为研究信号通路提供了好的模式系统。

人的肠内分泌细胞系 HuTu－80、NCI－H 716中Ga－gust与特异性味觉受体共表达［12］。HuTu－80细胞系表达hT1R3，h T2Rs，包括h T2R38。NCI－H 716细胞系表达 Ga－gust、h T2R38、T1R1、T1R2、T1R3、TRPM5［22］。事实上，肠内分泌细胞系STC－1、GLU Tag、HuTu－80、NCI－H 716表达味觉信号通路中的多个因子，说明了胃肠道内分泌细胞对腔内容物的化学成分的感知起到重要作用。

5 胃肠道细胞中苦味信号转导通路

有关口腔内味觉的信号通路已经很清楚了。例如苦味的识别，苦味剂与T2Rs特异性配对后，G蛋白就和受体偶联，引发信号的转导。此过程会有2条转导通路：一种是受体和配体结合后激活Ga，活化磷酸二酯酶PDE，水解cAMP，解除了环核苷酸（cNMP）对离子通道的抑制，Ca2＋浓度升高，导致膜去极化和神经递质的释放。另一种是受体和配体结合后，G蛋白的βγ亚基分离，激活磷脂酶β2（PLCβ2），PLCβ2把磷脂酰肌醇－4，5－二磷酸［PI（4，5）P2］水解成二三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（DAG），IP3和特异性受体结合后，Ca2＋浓度升高，导致膜去极化和神经递质的释放［9］。

有关胃肠道内分泌细胞的苦味、甜味信号转导通路还没有完全弄清楚。最初的研究发现，当STC－1、HuTu－80、NCI－H 716、AR42J细胞受到苯酸苄铵酰胺（DB）、苯基硫脲（PTC）、cycloheximide（CYX）等苦味剂的刺激后，细胞内Ca2＋浓度明显升高［6，11，12，30，31］，所 以 我 们 就 推 断，口 腔 内 特 异 性 味 觉的信号通路在内分泌细胞中也发挥作用。

L型电压敏感性Ca2＋通道（VSCCs）能介导细胞外Ca2＋流入神经元和神经内分泌细胞，使细胞去极化［32］。当有 L－VSCCs的阻断剂nitrendipine和diltiazem时，由DB、PTC、CYX等苦味剂刺激细胞时，Ca2＋浓度并没有升高，说明了STC－1细胞内Ca2＋浓度升高是由开放型的 L－VSCCs介导的［30］。而在不表达T2Rs和G蛋白的多细胞系中，当受到DB、PTC、CYX等苦味剂刺激后不能引起细胞内Ca2＋浓度升高［6，11，12，30］。不同的苦味剂和各自特异性的苦味受体结合后可能会引起不同的信号通路。

6 甜味、苦味剂诱导胃肠道多肽类的释放

我们现在推断，甜味、苦味剂使胃肠内分泌细胞Ca2＋浓度升高，引发了CCK、PYY、GLP－1多肽类物质的释放，这些多肽类物质刺激了局部的神经中枢的条件反射和（或）迷走输入通路，激活了胰腺β细胞等周围目标细胞的活性。

现在的研究主要集中在活体体内，对小鼠、大鼠进行不同的处理来验证这些信号通路的正确与否。在给缺失Ga的小鼠填喂糖类物质时，血液中的GLP－1浓度并没有升高，相反，这些小鼠的胰岛素分泌受损，高血糖明显［22］。除此之外，缺失 Ga或T1R3的小鼠，甜味受体的激活能够激活Na＋/葡萄糖共转运载体GLUT2的表达［16］。对小鼠的空肠灌注不同的甜味剂（包括人工合成剂）时，葡萄糖转运载体GLUT2的表达量升高［15］。这些研究均表明了，味觉信号分子的识别能够引起肠细胞对糖的吸收、调节胰岛素的分泌等一系列生理生化反应。

7 小结和展望

口腔内味觉信号通路在胃肠道中也能发挥作用这一推断，得到了大量实验有力地证明。现在已经确定，特异的味觉分子转导器，包括T1Rs、T2Rs、Gat－2、Ga－gust、PLCβ2、TRPM5在小鼠、大鼠、人的肠内分泌细胞系中表达。最新的研究发现，Ga－gust与GLP－1、PYY共定位于人和啮齿动物粘膜的肠内分泌L型细胞中。大量的实验显示，甜味、苦味剂能够引起培养的肠内分泌细胞分泌CCK、GLP－1、GIP胃肠多肽类物质。对小鼠进行空肠灌注甜味剂后，血液中的GLP－1浓度升高。而在缺乏Ga或T1R3的小鼠上没有发现此类现象。

L细胞分泌的GLP－1、PYY和I细胞分泌的CCK使小鼠产生了厌食反应。GLP－1、PYY与食物摄取量的基本调控机制有关联，也许也与由新陈代谢紊乱引起的疾病有关，例如II型糖尿病。GPCRs是目前许多治疗药物的靶目标，胃肠道细胞中与化学感应有关的GPCRs的鉴定、识别能为研究出新型的治疗药物提供新的思路。

目前关于味觉信号通路的研究都集中在小鼠、大鼠和人上，在牛等反刍动物上还未见相关报道。反刍动物氨基酸的营养需要研究一直以来就是个热点和难点，难点主要体现在：反刍动物采食的氨基酸有一部分会被瘤胃微生物降解，并且其代谢和生产的氨基酸需要量受生理状态和生产水平的影响，因此研究人员很难准确直接测定氨基酸的需要量；其次是，关于氨基酸的吸收和体内氨基酸平衡的调控机制还没有完全搞清楚。而氨基酸在反刍动物生产性能的发挥中所起的重要作用又使得搞清楚氨基酸需要成为一个迫切的问题。动物机体存在氨基酸的快速识别系统，特别是T1R1和T1R3能以异源二聚体的形式在氨基酸的识别中发挥重要作用，所以，我们可以从体内氨基酸识别入手来研究反刍动物氨基酸的摄取与消化吸收的调控机制，从而为反刍动物饲料的营养配制提供指导作用。

［1］Chandrashekar J，Mueller K L，Hoon M A，et al.T2Rs function as bitter taste receptors［J］.Cell，2000，100：703－711.

［2］Adler E，Hoon M A，Mueller K L，et al.A novel family of mammalian taste receptors［J］.Cell，2000，100：693－702.

［3］Matsunami H，Montmayeur J－P，Buck L B.A family of candidate taste receptors in human and mouse［J］.Nature（London），2000，404：601－604.

［4］Li X，Staszewski L，Xu H，et al.Human receptors for sweet and umami taste［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99：4692－4696.

［5］Nelson G，Chandrashekar J，Hoon M A，et al.An amino－acid taste receptor［J］.Nature，2002，416：199－202.

［6］Wu S V，Chen M C，Rozengurt E.Genomic organization，express and function of bitter taste receptors（T2R）in mouse and rat［J］.Physiol Genomics，2005，22（2）：139－149.

［7］Catherine Dulae.The physiology of taste［J］.Cell，2000，100：607－610.

［8］Conte C，Ebeling M，Marcuz A，et al.Evolutionary relationships of the Tas2rreceptor gene families in mouse and human［J］.Physiol Genomics，2003，14：73－82.

［9］Margolskee R F.Molecular mechanisms of bitter and sweet taste transduction［J］.Biol Chem，2002，277：1－4.

［10］Gilbertson T A，Damak S，Margolskee R F.The molecular physiology of taste transduction［J］.Curr Opin Neurobiol，2000，10：519－527.

［11］Wu S V，Rozengurt N，Yang M，et al.Expression of biter taste receptors of the T2Rfamily in the gastrointestinal tract and enteroendocrine STC－1cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A ，2002，V99：2392－2397.

［12］Rozengurt N，Wu S V，Chen M C，et al.Colocalization of the alpha－subunit of gust ducin with PYY and GLP－1in Lcells of human colon［J］.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol，2006，291：G792－G802.

［13］Parry C M，Erkner A.Divergence of T2Rchemosensory receptor families in human，bonobos and chimpanzees［J］.PNAS，2004，101（41）：14830－14834.

［14］Dyer J，Salmon K S，Zibrik L，et al.Expression of sweet taste receptors of the T1Rfamily in the intestinal tract and enteroendocrine cells［J］.Biochem Soc Trans，2005，33：302－305.

［15］Mace O J，Affleck J，Patel N，et al.Sweet taste receptors in rat smal lintestine stimulate glucose absorption through apical GLUT2［J］.JPhysiol，2007，582：379－392.

［16］Margolskee R F，Dyer J，Kokrashvili Z，et al.T1R3and gustducin in gut sense sugars to regulate expression of Na＋－glucose cotransporter1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A2007，104：15075－15080.

［17］Ruiz－Avila L，Wong G T，Damak S，et al.Dominant loss of responsiveness to sweet and bitter compounds caused by a single mutation in alpha－gustducin［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98：8868－8873.

［18］Hoefer D，Pueschel B，Drenckhahn D.Tastereceptor－like cells in the rat gut identified by expression of alpha－gustducin［J］.Proc Natl Acad Sci U S A1996，93：6631－6634.

［19］Sutherland K，Young R L，Cooper N J，et al.Phenotypic characterization of taste cells of the mouse small intestine［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292：G1420－G1428.

［20］Hoefer D，Drenckhahn D.Identication of the taste cell G－protein ，alpha－gustducin，inbrush cells of the rat pancreatic ductsystem［J］.Histochem Cell Biol1998，110：303－309.

［21］Bezencon C，le Coutre J，Damak S.Taste－signaling proteins are coexpressed in solitary intestinal epithelial cells［J］.Chem Senses 2007，32：41－49.

［22］Jang H J，Kokrashvili Z，Theodorakis M J，et al.Gut－ex－pressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon－like peptide－1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A 2007，104：15069－15074.

［23］Rehfeld J F.The new biology of gastrointestinal hormones［J］.Physiol Rev1998，78：1087－1108.

［24］Gautier J F，Fetita S，Sobngwi E，et al.Biological actions of the incretins GIP and GLP－1and the rapeutic perspectives in patients with type2diabetes［J］.DiabetesMetab2005，31：233－242.

［25］Hansotia T，Drucker D J.GIP and GLP－1as incretin hormones：lessons from single and double incretin receptor knock out mice［J］.Regul Pept 2005，128：125－134.

［26］Drucker D J.The role of gut hormones in glucose homeostasis［J］.J Clin Invest 2007，117：24－32.

［27］Cummings D E，Overduin J.Gastrointestinal regulation of food intake［J］.J Clin Invest，2007，117：13－23.

［28］Schonhoff S E，Giel－Moloney M，Leiter A B.Minireview：development and differentiation of gut endocrine cells［J］.Endocrinology，2004，145：2639－2644.

［29］Roth K A，Kim S，Gordon J I.Immunocytochemical studies suggest two path ways for enteroendocrine cell differentiation in the colon［J］.Am J Physiol 1992，263：G174－G180.

［30］Chen M C，Wu S V，Reeve J R Jr，et al.Bitter stimuli induce Ca2＋signaling and CCK release in enteroendocrine STC－1 cells：role of L－type voltage－sensitive Ca2＋channels［J］.Am J Physiol Cell Physiol2006，291：C726－C739.

［31］Masuho I，Tateyama M，Saitoh O.Characterization of bitter taste responses of intestinal STC－1cells［J］.Chem Senses 2005，30：281－290.

［32］Catterall W A，Striessnig J，Snutch T P，et al.International U－nion of Pharmacology XL.Compendium of voltage－gated ion channels：calcium channels［J］.Pharmacol Rev，2003，55：579－581.