非水相中脂肪酶催化合成糖酯类食品添加剂的研究进展

戴清源，朱秀灵

（1.安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000;2.微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖 241000）

非水相中脂肪酶催化合成糖酯类食品添加剂的研究进展

戴清源1，2，朱秀灵1

（1.安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000;2.微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖 241000）

糖酯类食品添加剂是同时含有亲水和疏水基团、HLB值为1～16的一种非离子型表面活性剂，具有无臭、无味、无毒及优良的表面性能等特点，在食品工业中具有诱人的应用前景。脂肪酶非水相催化合成糖酯有着化学合成法无可比拟的优点，已引起众多研究者的广泛关注。本文就非水相中催化合成糖酯所用脂肪酶的来源、非水相体系、酶的催化活性、糖酯类食品添加剂的检测方法及其在食品工业中的应用进行了综述，并展望其发展前景。

脂肪酶催化，非水相，糖酯

食品添加剂被誉为现代食品工业的灵魂和食品工业创新的秘密武器［1］。糖酯类食品添加剂是以碳水化合物分支为亲水基团、一个或多个脂肪酸作为疏水基团，同时具有亲油和亲水基团的一种非离子型生物表面活性剂，是联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）等推荐使用的食品添加剂［2］。但目前市场上出售的糖酯大多由化学法合成，反应条件苛刻，通常需要在高温、高压下进行，对酯键位置的选择性差，酯键数量难于控制，高温条件下易导致底物和产物的焦化、碳化，使产物色泽过深，与现在人们所追求的绿色化学不相适应。而采用生物酶催化法合成糖酯，具有反应条件温和、易于控制、对酯键位置的选择性较高、无二次污染、对环境友好等优点，日益受到人们的重视［3］。脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3），即三酰基甘油酰基水解酶（triacylglycerol acylhydrolases），是在油水界面上催化水解甘油三酸酯生成相应的脂肪酸和甘油的一类特殊的酯键水解酶［4］。自1984年Zaks A和Klibanov AM首次发表了关于非水相中脂肪酶的催化行为及热稳定性的研究报道［5］，非水相中脂肪酶的催化合成引起了广泛的关注。本文就非水相中催化合成糖酯类食品添加剂的脂肪酶来源、非水相体系、脂肪酶在非水相中催化活性、糖酯类食品添加剂的检测方法及在食品工业中的应用进行了综述，以便于作者或相关学者更好地理解和深入探讨与其相关的科学问题（如脂肪酶催化机理），寻求解决问题的方法和措施。

1 常用于糖酯合成的脂肪酶

脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中，由于微生物种类多、繁殖快、易变异，且微生物脂肪酶来源丰富、作用pH和作用温度范围广，适合于工业化生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源［6］。

目前，常用于合成糖酯的酶类主要是水解酶类，包括脂肪酶、蛋白酶等。脂肪酶是最早用于合成糖酯类化合物、也是非水相中酶促合成糖酯使用频率最多的酶类［7－8］。其中，源于 Thermonyces lanuginosus的脂肪酶、源于 Candida antarctica的游离脂肪酶CAL－ B 及 固 定 化 脂 肪 酶 Novozym 435［9－10］、源 于Pseudom onas cepacea的脂肪酶 PSL、源于 Candida cylindracea的脂肪酶CCL以及猪胰脂肪酶PPL最为常用［11］。其它微生物脂肪酶，如Rhizopus delemar脂肪 酶［12］、Pseudomonas cepacia、Mucor miehei 和Thermomyces lanuginosus脂肪酶也可用于糖酯的合成［13］。例如，采用 Mucor miehei脂肪酶在 2－甲基－2－丁醇溶液中催化果糖和油酸，果糖油酸酯得率可达到83%;在异丙醚中采用猪胰脂肪酶对各种单糖进行乙酰化，1－O－酰化果糖苷最高得率为70%［8］。通常情况下，应根据合成终产物——糖酯的类型、特征及合成条件等合理选择脂肪酶。

2 脂肪酶催化合成糖酯的非水相体系

生物酶催化过程具有温和、高效和专一的特点，但均是在水相中进行的。而在非水相体系中，酶的活性低于其在水相中的活性;另外，具有亲水性的糖分子在有机溶剂中的溶解度较低，不能与脂肪酸互溶形成均相，很难进行糖酯的合成反应。除此之外，许多具有较强亲水性的有机溶剂（例如，吡啶、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺）能很好地溶解糖和脂肪，但会导致酶稳定性的大幅下降［3］。因此，有效选择非水相体系，以提高非水相中糖分子的浓度，同时又能保持脂肪酶较高的活性和稳定性是实现糖酯酶促合成的有效途径［8］。

非水相酶催化主要用于实现那些在水相中无法或难以进行的反应，包括底物不溶于水的反应和存在水解副反应的反应。非水相体系主要包括有机溶剂体系、无溶剂体系（solvent－free system）、离子液体、超临界流体等体系［3，14－17］。

2.1 有机溶剂体系

有机溶剂体系中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应，适用于底物或者产物为疏水性物质的酶催化反应。与水相反应相比，有机相酶催化反应具有以下优点:增加疏水性反应物的溶解度，提高其转化效率;促使反应平衡向合成糖酯的方向移动;控制或改变酶对底物的专一性和选择性;增加酶的稳定性。然而，在某些情况下，有机溶剂会导致酶变性或抑制酶的活性;此外，具有亲水性的反应底物——糖类及其配糖体在有机溶剂中溶解度低，也不利于糖酯合成。因此，在为某一反应体系选择溶剂时应考虑底物和产物在其中的溶解度、溶剂的挥发性及其毒性、反应的后处理以及成本等。常用于糖酯合成的有机溶剂主要有吡啶、叔丁醇、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、2－甲基－2－丁醇、丙酮等一种或者两种溶剂的混合溶液［8］。Degn 等［18］在考察有机溶剂及其混合溶液对固定化C.antarctica脂肪酶催化合成肉豆蔻酸糖酯的影响时，发现有机溶剂的组成、反应温度、葡萄糖和肉豆蔻酸的相对含量对肉豆蔻酸葡萄糖酯合成速率都会产生不同程度的影响。当有机溶剂体系由单一叔丁醇变化到叔丁醇:吡啶（55∶45，v∶v）混合溶液、反应温度由45℃增加到60℃时，肉豆蔻酸葡萄糖酯合成速率由3.7μmol·min－1·g－1增加到20.2μmol·min－1·g－1。在叔丁醇:吡啶混合溶液中加入DMSO（浓度大于2%）会导致酶的活性降低。另外还发现，在有机溶剂体系中溶解的和大量未溶解的葡萄糖都参与了酶促转化，使肉豆蔻酸葡萄糖酯产量（34mg·mL－1）达到最大。在叔丁醇:吡啶体系中，可以实现果糖、α－D－甲基吡喃葡萄糖苷和麦芽糖与肉豆蔻酸的酶催化合成糖酯，三者产率分别为 22.3、26.9 和1.9μmol·min－1·g－1，但却不能实现麦芽三糖、纤维二糖、蔗糖和乳糖的酶催化合成糖酯。由此看出，能溶解糖类物质的有机溶剂，如吡啶和DMF，有助于糖酯的酶促合成，但是会降低酶的催化活性，进而影响到酶催化反应的进行。

2.2 无溶剂体系

无溶剂体系是以纯底物作为溶剂，底物浓度高、反应速度快、产品得率高、且避免了有毒物质的引入、使产品的安全性更高，有效地减少了后处理步骤，既降低生产成本，又减少环境污染，适于产品的大批量生产。因此，无溶剂体系中脂肪酶催化研究越来越受到青睐［19］。Adnani等［20］以固定化 Candida antarctica脂肪酶B为催化剂，在无溶剂体系中研究了木糖醇和两种脂肪酸（capric和caproic acid）的酯化反应，最佳反应条件分别为:反应时间29、18h，底物摩尔比0.3和1.0，加酶量0.20、0.05g，在此条件下，达到最大相对转化率分别为74.05%和60.5%。

2.3 离子液体

离子液体（ionic liquids）是近几年来研究较热的一种新型反应介质，它是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的低熔点盐类，在室温或较低温（＜100℃）下呈液态，通常称为室温离子液体（room－temperature ionic liquids）。具有无挥发性（无蒸气压）、安全性和溶解性好、化学稳定性和热稳定性好、可以循环利用及对环境友好等特点，故称为“绿色溶剂（green solvents）”［3，11］。离子液体对碳水化合物有着较强地溶解能力，作为碳水化合物生物转化的良好反应介质，用于糖酯的酶促合成研究已陆续有报道。Park等［21］以Novozyme 435为催化剂，分别以离子液体1－甲氧乙基－3－甲基咪唑四氟硼酸盐（［MOEM Im］［BF4］）和丙酮为反应介质，研究了脂肪酶催化葡萄糖和乙酸乙烯酯（作酰基供体）的酰化反应，在两种反应介质中葡萄糖的转化率分别为99%和72%，产物中单酯（6－O－乙酰葡萄糖）含量分别是93%和76%，表明脂肪酶Novozyme 435在离子液体中比在丙酮中具有更高地活性和区域选择性。由于离子液体价格较有机溶剂昂贵，且具有较高的粘度，影响了底物和产物的传质，降低了酶促反应速度，增加了反应液过滤和酶分散的困难，因此，离子液体中酶促合成糖酯类食品添加剂的研究尚有待于进一步深入探讨。但离子液体作为绿色反应介质具有传统有机介质不可比拟的优良性质，将其用于糖酯合成将有诱人前景。

2.4 超临界流体

超临界流体（supercritical fluid）是一种超过临界温度和临界压力的特殊物质，物理性质介于液体和气体之间，如CO2、氟利昂等，具有黏度小、易扩散、溶解性好、无毒及产物易分离等特点，越来越多地被用作非水相介质［19，22］。用超临界 CO2代替庚烷作反应介质，在超临界CO2中采用脂肪酶催化乙酸乙酯和异戊醇进行醇解反应，反应速度提高了3倍［23］。

3 非水相中脂肪酶的催化活性

传统观念认为酶只能在水溶液中进行反应，而自1984年Zaks A和Klibanov AM首次发表了关于非水相中脂肪酶的催化行为及热稳定性的研究报道后［5］，人们发现酶在与水溶液环境相差很大的非水相体系中也表现出相当高的催化活性。非水相中脂肪酶的催化活性受到很多因素影响，包括有机溶剂、水、pH、温度及酶的利用形式等。

3.1 水对非水相中脂肪酶催化活性的影响

水在非水相酶催化反应中起着关键作用，水分子直接或间接地通过氢键、疏水作用、范德华力等维持着酶分子催化活性所必需的三维构象，水的除去将导致这些构象的改变而使酶失活。靠近或结合在酶活性部位的水分对保持酶的微水相环境是必需的。强极性溶剂、亲水性过强的低相对分子质量底物或强脱水剂都可能攫取保持酶活所必需的水，从而使酶失活。因此，适当的水对酶的催化作用是必需的，但过多的水也会降低酶的催化活力［23］。

3.2 有机溶剂对脂肪酶催化活性的影响

有机溶剂主要通过酶分子周围的水来影响酶的催化活性，溶解于酶周围水分子层的有机溶剂与酶分子直接发生作用，通过干扰酶分子中的氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活。有机溶剂还可直接和酶分子周围的水相互作用，通过影响水在有机溶剂相和催化剂相之间的分配来影响酶的催化活性。一般认为，溶剂的疏水性越强，溶剂与酶分子争夺水分子的能力越小，保留在酶分子表面的水分越多，酶活性也就越大，溶剂对酶活的影响也就越小［23］。Zaks等［24］研究了 3 种不同的酶在不同的有机溶剂中的酶反应，发现在溶解度限制范围内，酶活都随着有机溶剂中水分含量的增加而提高，且达到最大酶活所需的水分含量，疏水溶剂比亲水溶剂少。此外，有机溶剂还和能扩散的底物或反应产物相互作用，对酶催化反应的动力学参数产生影响。

3.3 pH、温度对脂肪酶催化活性的影响

不同来源的脂肪酶其最适pH不同。许多Bacillus lipases最适pH是在酸性范围内（pH＜6.0），如源于Bacillus sp.的脂肪酶在pH为5.5～7.2时活性最强。一般情况下，Bacillus lipases在pH 7.0～9.0范围内较为稳定，但仍有一些酶类在很宽的pH范围内仍能保持较高活力，如Bacillus sp.脂肪酶在pH 5.0～11.0条件下处理24h活性不变。与此相反，B.subtilis 168脂肪酶在强碱性条件下较为稳定，pH 12.0处理24h仍保持其最初活性，pH 13.0处理24h其活性为最初活性的 65%［6］。

温度对脂肪酶活性影响也不同，如源于Bacillus sp.H1的脂肪酶在70℃时活性最大，当中60℃、pH 7.0条件下处理20h后其活性为最初酶活的80%［6］。

3.4 非水相中脂肪酶的利用形式对酶活的影响

非水相中脂肪酶的利用形式一般有三种:酶粉、固定化酶和化学修饰酶。酶的利用形式不同，其催化活力也不同。在非水相中，由于酶的溶解度低，反应过程中易结块，所以酶活受到抑制，酶的可利用率降低。如果将酶固定化在惰性载体上，则可以提高酶在溶剂中的扩散效率和热力学稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。但是固定化载体、载体颗粒大小、表面积、孔径及溶剂等因素对固定化脂肪酶催化活性会产生一定的影响，甚至会导致酶活下降或丧失。Paula等［25］采用溶胶凝胶技术制备的聚硅氧烷－聚乙烯醇复合材料作为固定化猪胰脂肪酶的载体，通过对固定化和未固定化的猪胰脂肪酶作用条件（pH、温度和底物浓度）的比较，发现两者最适pH均为8.0，最适温度不同，前者为45℃，后者为40℃。猪胰脂肪酶固定化后适宜pH范围缩小，但在pH7.0～8.5范围内，其相对活性仍保持在较高水平（＞80%）。

脂肪酶粉虽然在非水介质中能够催化反应，但由于溶解度低，所以其催化效率也较低。但通过表面活性剂等化学修饰和界面激活作用、脂肪酶蛋白的侧链修饰、脂肪酶分子的定点突变和定向进化等优化酶催化性能的手段，可以使酶保持较高的活力和稳定性，目前已有较多的文献报道［19，26］。

4 糖酯类食品添加剂的检测方法

检测脂肪酶催化合成的糖酯类食品添加剂的方法主要有薄层色谱（TLC）法、高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱（GC）法等［27］。TLC法检测糖酯时样品用量少、展开时间短、显色方便，且分离效率高，是一种成本低、应用广泛的微量分离手段。分析成本低是薄层色谱法最突出的特点。除此之外，TLC法对样品预处理要求较低，对固定相、展开剂的选择自由度较大，分析方法易于操作，十分适合在实验室中进行样品的分析，是目前糖酯定性分析的主要方法，也是分离少量糖酯反应液最常用的方法，它不仅可以将产物与底物完全分离，而且可将不同酯化度的糖酯有效分开［28］。反相HPLC法检测糖酯类食品添加剂对样品预处理简单，色谱柱的选择范围宽，流动相的种类及比例可任意变化，分析时间较短，具有较强的分离能力和检测方式多样等优点，可以用于糖酯的定量和定性分析［29］。自20世纪80年代应用于蔗糖酯的分析中以来，发展特别迅速。GC法也是检测糖酯的常用方法［30］，但是由于它需要对样品进行衍生化处理，对不稳定化合物的检测易产生较大误差。

5 糖酯类食品添加剂的应用

糖酯是同时含有亲水和亲油基团的阴离子型表面活性剂，其亲水性基团糖水化合物含有多个羟基，控制羟基与脂肪酸的酯化程度，可以制成亲水－亲油平衡（HLB）值1～16的糖酯，适用范围很广。糖酯类食品添加剂具有优良的表面活性、生物相容性、可生物降解性和无毒、无臭、无刺激等优点，某些糖酯及其衍生物还具有抑菌、抗病毒和抗肿瘤等活性，已作为食品乳化剂、润湿与分散剂、食品质地改良剂、保鲜杀菌剂、结晶调节剂、抗老化剂等广泛应用于食品工业［9，31－33］。

糖酯可以和淀粉、蛋白质形成复合物，从而影响淀粉和蛋白质的理化性质。蔗糖酯与直链淀粉分子相互作用形成复合物，可以抑制淀粉回生，使面包长期保持新鲜口味。蔗糖酯与蛋白质分子相互作用，降低蛋白质对低pH、盐、乙醇、高温和剪切作用的敏感度，增加蛋白质的溶解度，使蛋白质不易絮凝［34］。Ann Barrett等［35］发现在面团中添加适量的糖酯，面团的耐揉性及冻融稳定性均有所增加，面包结构将更加细腻和松软，面包体积膨大，货架期延长。

不同糖酯具有不同的抑菌特性，蔗糖酯对微生物具有较广泛的抑制作用，其中对G+菌，特别是对形成芽孢的G+菌具有明显抑制作用。但蔗糖酯对乳酸菌的生长没有影响，故在发酵食品制造中仍可使用蔗糖酯［2］。糖酯的抑菌性与其酯化度密切相关。蔗糖月桂酸单酯较二酯或多酯的抑菌性强。6－O－麦芽糖月桂酸单酯可抑制Bacilluss sp.和Lactobacillus plantarum的生长，6－O－麦芽糖月桂酸单酯和6’－O－麦芽糖月桂酸单酯可抑制 Bacillusssp.和Escherichia.coli的生长，而6，6’－O－麦芽糖月桂酸二酯对微生物没有明显的抑制作用［9］。

糖酯作为食品乳化剂应用于冰淇淋的生产，随着糖酯HLB值的增加，冰淇淋的表面张力不断降低，在保持样品粘度变化不大的前提下，添加糖酯可防止脂肪分子的过度凝集而影响冰淇淋的质量，同时又能保证冰淇淋的融化速率与添加混合乳化剂的样品相似。高HLB值的糖酯可有效抑制糖类在水相中的结晶，而低HLB糖酯则可防止油脂的大结晶的生成，因此，糖酯作为结晶调节剂可用于巧克力的生产，以改善巧克力的口感［36］。

6 结论

糖酯类食品添加剂具有无臭、无味、无毒及优良的表面活性等特点，在食品工业中有着广泛的应用前景。非水相脂肪酶催化合成糖酯具有传统的化学合成法所无可比拟的优越性:反应条件温和、区域选择性高、易于控制、副产物少、节能减排、清洁环保等，世界各国都对非水相脂肪酶催化合成活性物质的技术非常重视，尽管目前的研究大都还处于基础研究阶段，进行工业化尝试的还不多，但是随着生物技术的发展尤其是酶制剂工业的发展，脂肪酶成本将不断降低，而酶活和稳定性不断增高，酶法清洁生产的优越性更加突出，脂肪酶非水相催化合成糖酯将越来越受到大家的青睐。

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Research progress of lipase－catalyzed synthesis
of carbohydrate esters as food additives in non－aqueous phase

DAI Qing－yuan1，2，ZHU Xiu－ling1
（1.College of Biology and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China;
2.Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation of Anhui Province，Wuhu 241000，China）

Carbohydrate fatty acid esters are non－ionic surfactants containing both hydrophilic and hydrophobic groups and having a wide range of hydrophilic－lipophilic balance（HLB）value from 1 to 16.These esters，which have several characteristics，such as odorless，tasteless，non－toxic and surface－active，have been applied to food industry with attractive prospects.Compared with chemical synthesis，lipase－catalyzed synthesis of carbohydrate fatty acid esters in non － aqueous has a lot of unexampled advantages，as a result，it has attracted many researchers’attention.In this paper，the source of lipase，non－aqueous system，catalytic activity of lipase in nonaqueous system，detection and application of carbohydrate fatty acid esters as food additive in food industry were summarized briefly.The prospects for future development of carbohydrate fatty acid esters were also introduced.

lipase－catalyzed;non－aqueous phase;carbohydrate fatty acid esters

TS202.3

A

1002－0306（2012）10－0385－05

2011－05－16

戴清源（1980－），男，硕士，讲师，研究方向:食品资源开发与利用。

安徽高校省级自然科学研究项目（KJ2011B026）;芜湖市科技计划项目（2009100016）。