培养结合PCR检测生物制品支原体污染的研究

张 娜，李书光，陈金龙，胡琳琳，沈志强

2.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600

支原体是一类缺乏细胞壁的最小微生物，能在细胞培养中生长繁殖。目前支原体污染组织、细胞、疫苗的现象越来越严重，据统计，有36%～87%的细胞株被支原体污染［1－2］，其中猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、莱氏无胆甾支原体占全部污染的98%［3］，其余的仅占2%。支原体污染严重时，宿主细胞特性发生变化，包括生长特性、酶结构、染色体及细胞膜成分并诱导细胞病变，影响细胞的功能和代谢［4］。因此，受支原体污染的细胞、组织等用于疫苗生产将产生不良后果。支原体检测方法主要有分离培养法、电镜法、血清学方法以及核酸探针法等，但都存在着种种不足［5］，本实验应用传统培养和PCR技术相结合的方法，综合利用传统培养方法的精准和PCR检测方法的快速，大大提高了检测效率，又不失其精准度。

1 材料与方法

1.1 材料 鸡滑液囊支原体和猪鼻支原体购自中国兽医药品监察所，Taq DNA 聚合酶、DL2000、p MD－18T均购自大连宝生生物工程有限公司，改良Frey氏液体培养基和固体培养基、支原体液体培养基和固体培养基均参照《中国兽药典》制备。1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计与合成 根据GenBank中报道的支原体基因序列及其他细菌基因序列就行同源性比对分析，设计合成4条引物，Z－1，Z－2，Z－J和Z－Z。Z－1和Z－2一对引物参考倪红霞等［6］，在此基础上补充2条下游引物Z－J和Z－Z，PCR扩增片段大小为280 bp左右。

1.2.2 检测样品总DNA的提取 检测样品为本公司所生产的不同批号和来源的各种疫苗半成品、成品，细胞株，血清等。……