I型鸭肝炎病毒vp3基因的截短表达及鉴定

罗 玄 ，张海涛，尹秀凤，黄显明，靳宇田 ，张小飞, ，潘 玲

(1.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102；3.江苏省农科院兽医研究所，南京 210014)

I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1,DHV-1)是引起雏鸭急性高度致死性传染病的病原，早在1949年美国学者Levine首次分离并报道了DHV[1]，但直到最近几年，才有学者陆续完成了DHV全基因组序列测定[2-4]。根据国际病毒分类委员会第九次报告，DHV-1属于小RNA病毒科Avihepatovirus病毒属[5]。DHV-1病毒基因组为长约7.7 kb的单链正股RNA分子，含有1个大的开放阅读框(open reading frame, ORF)，一级编码产物为一个多聚蛋白前体。该多聚蛋白在随后的翻译加工过程中，可被再次裂解，产生3种结构蛋白(VP0、VP3和VP1)和9种非结构蛋白2A1、2A2、2A3、2B、2C、3A、3B、3C和3D[2]。

由于目前尚无DHV-1结构蛋白的功能的相关报道，为了对DHV-1 VP3蛋白的免疫学功能进行研究，本试验尝试对随机选择的vp3截短基因进行表达，以获得VP3蛋白的部分截短蛋白，为将来为DHV-1 VP3蛋白的抗原表位、诊断试剂和新型疫苗等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体和血清 DHV-1 A66株为安徽省农业科学院提供的鸡胚适应株；工程菌DH5α、Rosetta-gami(DE3) pLysS、表达载体pET-32a(+)均由南京天邦生物技术研究所保存；克隆载体pMD 18-T购自TaKaRa公司；DHV-1阳性、阴性血清为南京天邦生物技术研究所制备及保存。

1.2 主 要 试 剂 RNAiso Plus、M-MLV反 转 录酶、RNA酶抑制剂、T4 DNA连接酶、DL 2000 Marker、rTaqDNA 聚合酶、限制性内切酶BamH I、EcoR I、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit均购自TaKaRa公司；HRP标记的山羊抗鸭IgG二抗购自KPL公司；Ni-NTA HiBind Purification Kit购自Novagen 公司；BCA蛋白定量试剂盒、DAB显色试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；DEAE-Sepharose阴离子柱购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank登录的DHV-1(A66株，DQ886445) vp3基因序列1-468位设计引物，上游引入BamH I位点，下游使用vp3自带的EcoRI酶切位点。……