甘蓝型油菜自交系的SSR遗传多样性分析

王同华，陈卫江，李 莓，王建喜，范连益，曲 亮，惠荣奎

（湖南省作物研究所，湖南 长沙 410125）

利用杂种优势是提高油菜生产水平的重要手段。育种实践表明正确评价自交系间的亲缘关系、遗传差异及性状互补等方面，对于杂种优势有效利用具有重要意义。但随着育种材料的频繁交流、育种方法的不断创新，导致材料间的系谱关系相互交错程度大幅度提高，传统的系谱分析法越来越难以满足育种材料遗传多样性评价的需要。

分子标记的出现为作物育种资源的遗传多样性分析提供了新的技术手段，特别是SSR标记具有数量丰富、重复性高、多态性高、共显性遗传等优点，已被广泛应用于作物的品种纯度和真实性鉴定、指纹图谱的绘制及遗传多样性分析等研究[1-5]。SSR标记分析具有较高的稳定性和可信度，是作物遗传多样性分析的首选分子标记之一[6]。笔者以湖南省作物研究所选育的16份甘蓝型油菜自交系为材料，通过SSR标记分析评价其遗传多样性，以期为油菜种质资源的有效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料16份，均由湖南省作物研究所选育。其中pol-CMS不育系3份，pol-CMS恢复系11份，温敏核不育系2份（表1）。

1.2 方法

1.2.1 播种与取样 2011年9月底将16份供试材料播种于湖南省作物研究所试验田（上季作物为水稻），于苗期（7叶期左右）每份材料摘取5个单株的幼嫩叶片置于2 mL离心管中，-20℃保存。

1.2.2 SSR分析 基因组DNA提取参照Murry等[7]的方法进行，并略有改进。34对SSR引物序列均来自于http：//ukcrop.net（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系与循环参数参照陆光远等[8]报道的方法进行，扩增产物在4%的琼脂糖凝胶中电泳检测，并在凝胶成像系统中进行观察、拍照。

表1 16份供试油菜材料的名称及来源

1.2.3 数据统计分析 根据SSR电泳图谱显示的结果，按照各引物在相同电泳迁移率位置上PCR扩增产物带的有无进行数据统计,其中有带记为1，无带记为0，组成1和0的原始矩阵。采用生物学软件NTSYS-pc2.10e进行数据分析，先利用SimQual程序计算材料间的遗传相似系数（Genetic Similarity,GS），获得相似系数矩阵，再用SHAN程序中的UPHMA进行聚类分析，并通过Treeplot模块生成聚类树状图,并以简单配对参数计算基因频率。按照Nei提出的公式计算SSR位点的多态性信息含量（Polymorphism information content,PIC），PIC=1-∑fi2，其中 fi为 i位点的基因频率[9]。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的多态性表现

34对SSR引物在16份供试油菜材料中共产生72条清晰的扩增条带，平均每对引物产生2.12条。扩增条带长度在100～650 bp之间，以150～350 bp的片段为主。图1为引物CB10364和MR049对供试材料的SSR扩增结果，其他引物的扩增效果基本与该引物的扩增效果相当。在34对SSR引物中，28对引物的PCR扩增条带在供试材料中表现出明显多态性，多态性比例为82.4%。多态性位点的PIC值在0.12～0.73之间，平均为0.39，其中以引物CB10427的最高（0.73），引物BnGMS633、BnGMS687、Na12-A02、Na12-E09、Na10-D11、Na10-D08的最低，平均为0.12。由此可见，研究选用的SSR引物具有较好的稳定性和多态性，也表明供试材料在这些位点存在较高的遗传变异。

表2 SSR引物序列信息

图1 引物CB10364和引物MR049对16份供试材料的SSR-PCR扩增

2.2 聚类分析

利用生物学软件NTSYS-pc2.10e对16份供试油菜材料进行聚类分析，结果表明供试的16份材料可以被完全区分开，各材料间的遗传相似系数在0.52～0.90之间，平均为0.63。其中，10个pol-CMS恢复系间的遗传相似系数在0.52～0.90之间，平均为0.61；3个pol-CMS不育系间遗传相似系数在0.71～0.86之间，平均为0.79；2个温敏核不育系间的遗传相似系数为0.90。如图2所示，在遗传相似系数为0.685时，供试材料可分为A、B、C 3个类群。A类群包含7份材料（5份pol-CMS恢复系、2份温敏核不育系）；B类群包含8份材料（4个pol-CMS不育系、4个pol-CMS恢复系）；C类群仅包含1份pol-CMS恢复材料。研究结果表明，在16份供试材料中，pol-CMS恢复系材料间存在较好的遗传多样性，pol-CMS不育系材料间的遗传多样性相对较差，2份温敏核不育系材料的遗传背景非常相近。

3 讨论

研究利用选取的34对SSR引物对16份供试油菜育种材料进行了遗传分析，结果表明在供试材料中，pol-CMS恢复系材料间具有较好的遗传多样性，而pol-CMS不育系材料与温敏核不育系材料的遗传多样性较狭窄。该结果可能与以上育种材料的选育方法密切相关，研究中pol-CMS恢复系大多通过同质恢复系进行选育，即通过已有杂交组合直接自交纯合，或利用已有的pol-CMS恢复系材料直接回交转育，其恢复系材料的遗传基础易于拓展，遗传背景相对广泛。而pol-CMS不育系的选育主要源于对已有不育系的回交改良，该类型不育系存在不同程度的低温敏感现象，因此pol-CMS不育系的选育对核心亲本的依赖性较强，往往几个不育系均含一个核心不育系的血缘。另外，研究中温敏核不育系材料由于受多对隐性基因控制，新型系转育更为困难，研究供试的2个温敏核不育系均来源于隐性核不育系86A后代分离群体，有着明显的遗传相似性。

对16份供试材料的聚类结果表明，来源于中国农业科学院油料研究所中油杂系列的Z2R、Z8R优先聚到一起，来源于隐性核不育系86A的91S、402S优先聚到一起，含有SC4的血缘的169A与SC4优先聚到一起，通过品质改良17A选育的不育系167A与17A也优先聚到一起。这充分说明SSR揭示的遗传多样性与地理来源和系谱来源基本一致，可以充分反映材料间的遗传差异。在该研究中恢复系95-5单独聚为一类，与其他材料间具有明显的遗传特异性，而在表型上该恢复系确实具有土黄色花瓣、种皮自然开裂等非常特殊的农艺性状，需注意对该特异种质资源的保存和利用。由此可见，SSR聚类结果较好地反映了材料间的亲缘关系，可为育种资源的有效利用提供参考。

[1]梅德圣，李云昌，胡 琼，等.甘蓝型油菜中油杂8号种子纯度的 SSR 鉴定[J].中国农学通报，2006，22（5）：49-52.

[2]吴朝晖.SSR标记及其在水稻遗传育种中的研究进展 [J].湖南农业科学，2007，（3）：36-39.

[3]赵卫国，王 灏，李殿荣，等.甘蓝型特高含油量油菜种质及其主栽品种的指纹图谱构建 [J].植物遗传资源学报，2011，12（6）：904-909.

[4]胡景涛，黄文章，严明建，等.重庆市杂交水稻主要亲本的SSR遗传多态性分析[J].湖南农业科学，2011，（4）：1-6.

[5]许 鲲，张冬晓，伍晓明，等.国家冬油菜区试新品种SSR指纹图谱构建与遗传关系分析 [J].中国油料作物学报，2008，30（1）：29-34.

[6]朱 英，陶 刚，祝云芳，等.利用SSR标记分析12份优良玉米自交系的遗传多样性[J].贵州农业科学，2011,39(8)：18-20.

[7]Murry H G,Thomspon W F.Rapid isolation of weight DNA[J].Nucleic Acides Res,1980,8：4321-4325.

[8]陆光远，杨光圣，傅廷栋.一个简便的适合于分析油菜中SSR位点的检测体系[J].中国油料作物学报，2003，25（3）：79-81.

[9]Nei M.Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].Proc.Natl.Acad.Sci.,1973,70：3321-3323.