间歇性低氧动物模型的建立及验证

李秀翠 蔡晓红 温正旺 梁冬施 曹顺顺 胡青青 潘国权 陈尚勤

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)指上呼吸道反复塌陷堵塞引起的呼吸暂停和通气不足，主要表现为打鼾，伴呼吸暂停、夜间反复低氧血症、高碳酸血症、睡眠结构紊乱以及白天嗜睡，儿童OSAHS发病率达1%～3%，老年人的发病率更高。研究表明OSAHS与冠心病、高血压病、动脉粥样硬化关系密切，越来越受到人们的重视［1～4］。间歇性低氧是其特征性的病理机制，IH模型普遍用于研究OSAHS的低氧机制，但IH模型是否有效地模拟OSAHS前人尚未充分验证，因此本实验建立并验证IH模型，以确保模型的有效性。

材料与方法

1.材料:SPF级雄性SD幼鼠20只，体重100±10g，温州医学院实验动物中心［SYXK(浙)2005－0061］提供;动物实验复合模拟舱及对照舱由本实验室联合潍坊华信氧业有限公司研制;其他主要仪器和材料:血气分析仪(GEM Premier 3000)、医用氧气和高纯度氮气(浓度＞99.99%，本市医用氧气厂)、水银体温计、秒表。

2.氧舱的制备:氧舱的建立参照 Nair等［5］和 Wang 等［6］等的方法加以改进。氧舱的主体设备主要由以下部分组成:①动物实验复合模拟舱:60cm×22cm×16cm;②动物实验对照舱;③氮气管道;④氧气管道;⑤空气管道;⑥空气压缩机;⑦气体流量控制阀;⑧PLC及电脑控制系统。氧舱侧壁上各有4个进气、排气单向阀，不同气源有不同的通气管道，均由程序控制电磁阀开关，舱内压力始终保持常压。通过自行设定实验参数及各种气体的流量值并输入电脑控制程序，调控舱内氧气浓度，模拟不同的IH环境，气体流入状态可通过控制程序经显示器读出，舱内氧浓度由舱内氧气检测仪读出。氧舱置于SPF级动物实验室内，所有仪器设备严格消毒后置入。氧舱示意图及舱体实物图见图1、图2。

3.模型建立:将20只SD幼鼠随机分为4组:90s 10%模型组(A)，60s 10%(B)模型组和60s 5%模型组(C)，空气对照组(D)，每组各5只。设置IH氧舱参数:低氧时间、常氧时间、每次循环时间、最低氧浓度上限、最低氧浓度下限、最高氧浓度上限、最高氧浓度下限，模型组参数 A组:45s、45s、90s、13.05%、10.80%、20.50%、19.00%;B 组:30s、30s、60s、13.15%、10.90%、20.55%、19.25%;C 组:30s、30s、60s、7.90% 、5.55% 、20.65% 、19.25% 。实验期间按照预设的参数向动物实验复合模拟舱内输送氮气和氧气，通过监测氧舱内的氧浓度及低氧时间来控制氮气和氧气的进气，保证最低氧浓度和最高氧浓度分别在如下范围内变化:A组和B组:10.0% ±1.5%、21.0% ±0.5%，C组:5.0% ±0.5%、21.0% ±0.5%。空气对照组置于动物实验对照舱内，向对照舱内输送空气，保证舱内温度和室内温度22～24℃，湿度40%～50%。氧舱内氧浓度随时间的变化可通过电脑界面显示，见图3。

图3 氧舱电脑界面

4.动物处理:给予大鼠3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于操作台上，分离颈总动脉，将注入肝素的留置针尾端连肝素帽，留置针插入颈总动脉，中间连接处用线扎好，缝合固定。待大鼠清醒时，测量呼吸、体温，然后依次将其置于上述建立的氧舱模型中，2h末测量大鼠体温、呼吸，模型组于电脑界面上正弦波达到最高点时开始抽血，D组任意时间点抽血，一个低氧－复氧周期抽血5次，同一实验组间隔相同的时间(A、D 组均间隔22.5s，B、C组间隔15s)，每次抽血时间＜3s，抽取0.5ml动脉血，迅速行血气分析，记录血气结果，5 个时间点的 PO2、SaO2分别表示为 P1、P2、P3、P4、P5，S1、S2、S3、S4、S5。动脉插管前、插管后及抽取动脉血的操作分别如图4a、b、c。

图4 动脉插管及动脉取血操作

5.统计学方法:实验数据采用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差±s)表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，各时间点之间的组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

结 果

1.各组大鼠体温和呼吸次数的比较:与D组比较，A、B、C模型组造模后呼吸明显加快，A、B、C组内比较，造模后呼吸较造模前明显加快(P＜0.05)，D组造模后呼吸与造模前比较无统计学差异(P＞0.05);各组间及组内体温无差异(P＞0.05)(表1)。

表1 4组大鼠体温和呼吸次数比较

2.4组大鼠 PO2及 SaO2比较:A、B、C 模型组组内5个时间点的PO2及SaO2比较:F分别为67.92、300.89，449.38、108.69，2037、931.18，P 均 ＜ 0.05，有明显差异;与其余4个时间点的PO2、SaO2比较，P3及 S3下降(P ＜0.05)，1和5，2和4时间点的 PO2及SaO2比较均无统计学差异(P＞0.05)。D组组内5个时间点的 PO2及 SaO2比较，F 分别为 1.61、2.15，P均＞0.05，无统计学差异。4组 PO2及 SaO2变化见图5。

3.4组P3及S3组间比较:与D组比较，模型组P3及S3降低(P＜0.05);与 A组比较，B组 P3及 S3升高(P ＜0.05)，C 组 P3及 S3降低(P ＜0.05);C 组 P3及S3较B组降低(P＜0.05)(表2)。

讨 论

图5 4组组内5个时间点的PO2及SaO2比较

表2 4组P3及S3组间比较

OSAHS特征性的低氧方式是慢性间歇性低氧，此低氧－复氧方式出现类似于缺血/再灌注过程中的病理变化，自从1992年Fletcher首次报道了慢性间歇低氧－复氧大鼠模型以来，陆续有报道间歇低氧－复氧睡眠呼吸暂停综合征的动物模型［7～9］，建立模型的实验装置有不同类型:①往复运动式低氧舱，是低氧舱在动物舱之间往复运动，使动物舱间歇进入低氧环境，可基本模拟反复缺氧－复氧的病理生理特征，但对设备要求高，操作复杂;②低压低氧舱，通过改变氧舱升降速率模拟不同的海拔高度，产生不同的压力和氧浓度，从而达到低氧－复氧的效果，对设备的要求较高，不能准确反映常压下缺氧的情况;③低O2高CO2箱，采用单片机技术和反馈原理，自动调节氧舱内O2、CO2浓度，建立低氧和CO2潴留模型，不能排除CO2在低氧－复氧机制研究中的干扰作用。本研究制备常压间歇性低氧氧舱来模拟睡眠呼吸暂停综合征，符合低氧、间歇性等特点，气源采用常用的医用氧和医用氮，而非混合气体，来源简便易得;舱内氧浓度、气体输送、低氧－复氧循环时间等均采用自动控制、自动监测，保证了实验条件的精确性和可靠性;采用氮气与氧气交替输送的方式，克服了前期一些实验模型中氮气(或低氧混合气)与空气交替输送方式带来的大容积舱氧浓度不易快速升高的不足;本实验氧舱模型可由实验者设定多项参数，研制不同低氧浓度和时间的IH模型、低氧高二氧化碳等多种氧舱模型，具备良好的人性化(图3)。

本实验IH氧舱模型的建立操作简便、控制精确、具备人性化，但IH模型是否能有效地模拟OSAHS尚需充分验证，许多学者将以下多种验证方法结合起来，如活动减少，睡眠增多，呼吸频率加快伴有鼾声等，本实验也表明缺氧时大鼠呼吸明显加快，但该标准带有主观性，只能作为大致的参考;多导睡眠监测对判断该模型与人类OSAHS的相符程度具有重要的参考价值，但可靠性不佳;模型动物的上呼吸道改变对于评价OSAHS模型也十分重要，但可操作性差，而动脉血气分析是评定IH模型动物与OSAHS病人低氧的重要依据，因此本实验通过血气分析评价IH氧舱模型中大鼠产生的低氧影响，验证模型的有效性及合理性［10］。

IH模型的低氧－复氧循环时间多为12～90s，最低氧浓度多为 5% ～10%［11～14］。本实验选取 90s 10%、60s 10%、60s 5%3个模型，血气分析结果显示:一个低氧－复氧周期内，模型组的PO2及SaO2有明显的波动，表明大鼠体内处于低氧－复氧状态，与IH氧舱内氧浓度的变化一致，验证了模型的有效性;OSAHS可对心血管、内分泌、血液、神经系统等多系统器官产生影响。本课题组前期已利用间歇性低氧大鼠模型成功模拟OSAHS对肺循环和右室功能的影响，神经系统海马、额叶皮质神经元凋亡，空间学习记忆损害等OSAHS对神经系统的影响，进一步验证了此模型的有效性。本研究组间比较结果提示不同的IH模型产生不同程度的低氧改变，同时表明低氧的程度与IH循环周期、低氧时间和最低氧浓度有关，从而本实验可以通过调整上述因素建立不同的IH模型，这与罗玲等的观点是一致的。本实验IH模型中最低氧饱和度分别为(75±3)%、(89±1)%、(52±4)%，通过血气分析结果中最低氧饱和度评价低氧的程度，根据阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊治指南(草案)判断模型的分度，得出90s 10%模型可以反映轻度OSAHS，90s 10%模型模拟中重度OSAHS，60s 5%模型可以较好地反映重度OSAHS的病理变化，证明本IH模型可以有效地模拟OSAHS。

综上所述，本实验IH氧舱模型的建立操作简便、控制精确、重复性佳，可模拟不同病情轻重的OSAHS，模型符合疾病的病理生理特点，是目前研究OSAHS低氧机制的理想实验模型。

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