卡介苗穿梭表达质粒p MS MCP－1的构建与鉴定＊

李杜渐 徐耀庭 韦 芳 李惠民 黄汝强 许晓文 顾 炜 顾伟平

1 上海市第一人民医院分院泌尿外科 200081； 2 上海交通大学附属上海市第一人民医院实验中心

卡介苗（Bacillus Calmette－Guerin，BCG）膀胱内灌注治疗表浅性膀胱移行细胞癌，是目前最成功的肿瘤免疫治疗。但与此同时其显著的毒副反应使得卡介苗在临床上的应用受到限制。因此利用基因工程技术改造BCG菌株，以加强其免疫原性和抗瘤作用是，降低其毒副作用是大家研究的热点。由于单核细胞趋化因子－1（MCP－1）在膀胱肿瘤免疫治

疗中起到重要作用且与BCG治疗效果有关。因此，本实验利用基因工程技术在克隆BCG Ag85B和MCP－1基因的基础上，将构建穿梭表达质粒，欲将该质粒导入BCG，使BCG表达分泌MCP－1，达到构建重组BCG的目的。

1 材料和方法

1.1 材料 Taq DNA 聚合酶、Eco RⅠ、SaⅡ、Bam HⅠ、T4DNA连接酶、DNA Marker DL2000、Marker DL15000购于上海皓嘉科技发展有限公司。BCG上海丹麦株由上海市生物制品研究所惠赠。质粒p M V261（Stover CK博士构建）由四川大学生命科学学院徐恒教授惠赠 。人MCP－1c DNA由上海交通大学附属上海市第一人民医院实验中心提供。大肠杆菌DH 5α感受态细胞购于天根生化科技（北京）有限公司。PCR产物纯化试剂盒购于上海华舜生物工程公司。

1.2 引物合成及聚合酶链反应（PCR）扩增 根据BCG抗原85B（BCG Ag85B）信号肽序列自行设计一 对引物。F5’端引入Bam HⅠ酶切位点，R：5’端引入Eco RⅠ酶切位点。F：5’GATGGA TCCAA T GACAGACGTGAGCCGAAAG3’；R：5’GTAGA A TTCCGCGCCCGCGGT TGCCGCTCC 3’。MCP－1的引物 设计，F：5’CGGA A TTCCACTCTCGCCTCCAGCA TGA AA3’，R：5’ACGCGTCGACGG GTTGTGGAGTGAGTGTTCAA3’。F：5’端引入Eco RⅠ酶切位点，R：5’端引入SaⅡ酶切位点。引物由上海皓嘉科技发展有限公司合成。PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性45s，60℃复性1min，72℃延伸1min，共循环30次，最后72℃继续延伸7min。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒参照产品说明书进行纯化。

1.3 质粒p M V261的提取和纯化 用碱裂解法提取质粒进行［1］。

1.4 重组质粒p MS的构建 将合成后的BCG Ag85B信号肽基因克隆至质粒p MV261并测序鉴定。信号肽基因及质粒p MV261分别用Bam HⅠ和EcoRⅠ酶双酶切，p MV261酶切后加入小牛肠碱性磷酸酶1U，于37℃去磷酸化1h，经酚∶氯仿（1∶1）抽提，无水乙醇沉淀、70%乙醇洗涤后溶于TE中。然后加入10×连接缓冲液2μL、T4DNA连接酶1μL，以纯水补足总体积为2μL，于16℃进行连接反应16h，构建重组质粒p MS。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及连接产物的转化按说明书进行。

1.5 阳性重组质粒p MS的筛选与鉴定 重组质粒p MS的筛选与鉴定参见文献［2］。

1.6 MCP－1基因与上述阳性重组质粒的连接和转化 纯化后的MCP－1基因c DNA和上述阳性重组质粒p MS用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切后，按照4方法连接与转化。

1.7 阳性重组质粒p MS MCP－1的筛选与鉴定按照4方法筛选由上海生工生物工程有限公司进行测序与鉴定。采用克隆位点上游的启动子序列作为测序引物进行测序。

2 结果

2.1 重组质粒p MS的鉴定 （1）酶切鉴定：选取经电泳初步检测比p M V261较大的质粒，将其用Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切，以酶切产物为模板，用信号肽两端引物进行PCR扩增，出现120bp左右的目的基因条带（见图1）。初步表明重组质粒构建成功，该重组质粒命名为p MS。（2）测序鉴定：用信号肽测序引物测序 ，由测序结果可知信号肽已经克隆到p M V261载体中 ，进一步证实了重组质粒p MS构建成功。

图1 重组质粒酶切鉴定图

2.2 重组质粒p MS MCP－1的鉴定 （1）酶切鉴定：选取经电泳初步检测比p MS较大的质粒，将其用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳显示，质粒已完全打开，出现4 188bp和300bp两条带，显示300bp的带为插入MCP－1片断，4 188 kb带为质粒p MS（见图1）。初步表明重组质粒构建成功，将其命名为p MS MCP－1。（2）测序鉴定：将p MS MCP－1阳性重组质粒进行序列分析。由上海生工生物工程有限公司进行测序，采用克隆位点上游的启动子序列作为测序引物进行测序，两种扩增产物的结果与理论值完全一致。由上述质粒构建过程可知，在p M V261的Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位点以及p MS的Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点之间，分别插入了一约120bp和300bp的片段，而得到一新重组质粒，120bp片段为BCG Ag85B信号肽，而300bp的片段为MCP－1基因 ，进一步证实了重组质粒p MS MCP－1构建成功。

3 讨论

人们对BCG治疗膀胱肿瘤的局部抗瘤免疫反应的研究中发现单核细胞趋化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）在BCG抗膀胱肿瘤过程中膀胱局部表达明显增强。膀胱内无瘤状态的维 持 与 MCP－1 的 水 平 表 达 关 系 密 切［3～5］。 对MCP－1前期的研究中发现MCP－1具有良好的抗膀胱 肿 瘤 作 用［6～8］。 笔 者 在 克 隆 BCG Ag85B 和MCP－1基因的基础上 ，构建了穿梭表达质粒。下一步将通过电穿孔法把该质粒导入BCG中，使BCG分泌表达MCP－1，从而达到构建重组BCG的目的。该重组BCG可望在免疫原性及抗瘤效应方面优于BCG。其理由有以下几点：（1）选用的穿梭表达质粒属于染色体外质粒，转化BCG后不会改变其染色体的结构与功能，因此不会改变BCG的减毒特性。（2）穿梭表达质粒可将 MCP－1基因转入BCG中，使重组BCG同时具有BCG和MCP－1的双重功能。（3）进行膀胱灌注时，重组BCG可直接接触和刺激肿瘤组织，局部表达的较高浓度的MCP－1既可直接杀死肿瘤细胞，也能够增强重组BCG介导的免疫应答。同时重组BCG和 MCP－1只黏附在肿瘤周围，不进入血液循环系统，故毒副作用减少。综上所述，通过构建了穿梭表达质粒p MS MCP－1，为下一步构建表达分泌性 MCP－1的重组BCG打下了坚实的基础。

［1］ Sambrook KJ，Fritisch EF，Maniatis T.Molecular cloning laboratory mannual〔M〕.2nd.New York：Cold Spring Harbour Labortory Press，1989：16，322.

［2］ 夏术阶，刘海涛，孙晓文，等.卡介苗穿梭表达质粒p MS肿瘤坏死因子的构建与鉴定〔J〕.中华实验外科杂志，2005，22（3）：495－497.

［3］ Luo Y，Chen X，O’Donnell MA.Mycobacterium bovis bacillus Calmette－Guérin（BCG）induces human CC－and CXC－chemokines in vitro and in vivo〔J〕.Clin Exp Immunol，2007，147（2）：370－378.

［4］ Reale M，Intorno R，Tenaglia R，et al.Production of MCP－1 and RANTES in bladder cancer patients after bacillus Calmette－Guerin immunotherapy〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2002，51（2）：91－98.

［5］ Méndez－Samperio P，Vázquez A，Ayala H.Infection of human monocytes with Mycobacterium bovis BCG induces production of CC－chemokines〔J〕.J Infect，2003，47（2）：139－147.

［6］ 李杜渐，杨宇如，魏强，等.单核细胞趋化蛋白－1对膀胱肿瘤荷瘤裸鼠的作用〔J〕.华西医学，2003，18（4）：536－537.

［7］ 李杜渐，陈一戎，王志平，等.单核细胞趋化蛋白－1对膀胱肿瘤浸润淋巴细胞增殖的作用〔J〕.现代泌尿外科，2004，9（3）：137－139.

［8］ 李杜渐，杨宇如，李响，等.单核细胞趋化因子及钟声蛋白样受体在卡介苗灌注膀胱局部抗肿瘤免疫反应中的表达〔J〕.临床泌尿外科杂志，2006，21（11）：859－862.