临床血液分离大肠埃希菌株耐药性及生物被膜形成分析

熊 杰，杨继勇，邹自英，朱 冰，汪 璐，曾 平

（1.中国人民解放军成都军区总医院检验科，成都610083；2.中国人民解放军总医院微生物科，北京100853）

临床血液分离大肠埃希菌株耐药性及生物被膜形成分析

熊 杰1，杨继勇2，邹自英1，朱 冰1，汪 璐1，曾 平1

（1.中国人民解放军成都军区总医院检验科，成都610083；2.中国人民解放军总医院微生物科，北京100853）

目的探讨该院血流感染产超广谱酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌（ECO）检出率及其对常用抗菌药物的耐药性及生物被膜形成能力。方法采用法国生物梅里埃公司的Vitek2－Compact全自动微生物分析仪进行鉴定和药物敏感性分析，采用结晶紫半定量方法检测菌株的生物被膜形成能力。结果92株ECO临床血液分离菌株中，产ESBLs菌株53株（占57.61%），ESBLs阴性菌株39株（占42.39%）。对3类以上抗菌药物耐药ECO 73株（占79.35%），其中，产ESBLs菌株52株，占总菌株数的56.52%，占产ESBLs菌株数的98.11%。耐药率最高的为氨苄西林（94.57%），其次为头孢唑啉（71.74%）和氨苄西林／舒巴坦（67.39%）；环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均在60%以上。对于临床常用的氨苄西林／舒巴坦、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类的妥布霉素和单酰胺类抗菌药物，与ESBLs阴性菌株相比，产ESBLs菌株的最小抑菌浓度（MIC）值显著升高，耐药率显著升高（P＜0.05）。而对头霉素类、呋喃类、氨基糖苷类的庆大霉素和阿米卡星、含酶抑制剂的哌拉西林／他唑巴坦和碳青霉烯类抗菌药物的敏感性ESBLs阳性组与ESBLs阴性组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。96.74%的ECO临床血液分离株具有生物被膜形成能力，生物被膜形成量以中量为主。结论该院ECO血液分离菌株产ESBLs比例高，生物被膜形成能力强，呈现多药耐药的特征。

血标本；肠产毒性大肠杆菌；β内酰胺酶类；生物膜；抗药性

大肠埃希菌（ECO）是引起医院感染的重要病原菌之一，是革兰阴性杆菌中产超广谱内酰胺酶（ESBLs）的代表菌种，分子流行病学研究结果表明，ESBLs基因型包括SHV、TEM、CTX－M型等，而CTX－M型是包括中国在内的全球流行ESBLs基因型［1］。随着头孢菌素在临床的广泛应用及产ESBLs菌株的增加，加速了耐药质粒的传播，使ECO对多种广谱和超广谱抗菌药物的耐药性增加。同时，ECO是典型的生物被膜菌，细菌生物被膜是细菌感染难以治愈和反复发作的重要原因［2］。本研究收集本院临床送检的所有血液标本分离的ECO菌株，分析ESBLs的检出情况及菌株的耐药性，并检测各菌株的生物被膜形成能力，为医院ECO感染控制和临床抗菌药物使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 分离自2010年10月至2011年12月临床送检的血液标本，同一患者的重复分离菌株不予统计。

1.2 菌株鉴定和药敏试验 采用法国梅里埃公司的Vitek2－Compact全自动微生物分析仪及GN鉴定卡对细菌进行鉴定，AST－GN13药敏卡检测菌株的药物敏感性。结果评价按2012年美国临床实验室标准化协会（CLSI）M100－S22判断。ASTGN13检测的抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦、头孢吡肟、头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、头孢替坦、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因。头孢噻肟、头孢噻肟／克拉维酸、头孢他啶和头孢他啶／克拉维酸药敏纸片为英国Oxoid公司产品。

1.3 ESBLs确证试验 AST－GN13药敏卡通过 Vitek2－Compact全自动微生物分析仪检测提示ESBLs阳性菌株均按CLSI推荐的方法，将0.5麦氏单位菌液均匀涂布 M－H平板，将头孢噻肟（30μg）和头孢噻肟／克拉维酸（30μg／10μg）、头孢他啶（30μg）和头孢他啶／克拉维酸（30μg／10μg）黏贴在涂布菌液的M－H平板上，35℃培养18h，测量抑菌圈直径，两对纸片或其中任何一对纸片的直径相差大于或等于5mm，即为产ESBLs菌株。

1.4 质控菌株 阴沟肠杆菌ATCC700323、ECO ATCC25922、ESBLs阳性肺炎克雷伯菌ATCC700603购自卫生部临检中心。

1.5 细菌生物膜半定量检测 采用半定量结晶紫染色法，操作方法参照文献［2］，略作改动。将菌液培养至对数期，用新鲜M－H培养液调节菌液浓度为1×109CFU／mL，接种于96孔板中，每孔200μL，每株菌设3个复孔，37℃静止培养48h，24h换液1次。轻轻弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）（每孔200 μL）轻柔的清洗4次，弃去上清液。每孔加入Bouin′S固定液50μL，固定1h，轻轻倒去液体，PBS清洗4次。每孔加入50 μL结晶紫，染色2min，轻轻倒去液体。用自来水轻轻冲洗96孔板，直至阴性对照没有颜色，室温晾干，95%乙醇脱色。酶标仪测定A570，阴性对照组为M－H培养液。生物膜形成量判断标准：以阴性对照的平均A570加标准差定义为Ac，待测菌株A与Ac比较，将菌株生物膜形成能力分为4类：阴性（－）：A＜Ac；少量（1＋）：Ac＜A≤2Ac；中量（2＋）：2Ac＜A≤4Ac；大量：A＞4Ac。

1.6 统计学处理 采用 WHONET4.5软件录入数据分析。采用SPSS17.0软件进行组间数据分析，计数资料以百分率表示，组间分析采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ECO临床血液分离株的耐药性分析 92株ECO临床血流分离菌株中，产ESBLs菌株53株，占57.61%，ESBLs阴性菌株39株，占42.39%。对3类以上抗菌药物耐药ECO 73株，占79.35%，其中，产ESBLs菌株52株，占总菌株数的56.52%，占产ESBLs菌株数的98.11%。ECO临床血液分离株对常用抗菌药物的耐药性，见表1。

2.2 ECO临床血液分离株的生物被膜半定量检测结果96.74%的ECO临床血液分离株具有产生生物被膜能力，以产生中量生物被膜菌株比例最高（75.00%）。ECO临床血液分离株产生生物被膜能力，见表2。

表1 临床血液分离ECO对常用抗菌药物的耐药率（%）

续表1 临床血液分离ECO对常用抗菌药物的耐药率（%）

表2 临床血液分离ECO生物被膜形成能力

3 讨 论

ESBLs是由质粒介导的一类β－内酰胺酶，能水解含氧亚氨基的β－内酰胺类抗菌药物，并可被β－内酰胺酶抑制剂克拉维酸抑制。本研究结果显示，92株ECO临床分离株检出产ESBLs菌株53株，占57.61%，高于多篇文献报道的检出率［3－8］，ESBLs的高检出率，给临床抗感染治疗带来很大压力和挑战，随着抗菌药物的不合理使用，ESBLs菌株的检出率势必还将持续升高。92株ESBLs菌株对亚胺培南、厄他培南、头孢替坦、哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星和呋喃妥因较敏感，耐药率小于10%，与ESBLs阴性菌株比较差异无统计学意义（P＞0.05）；对氨苄西林的耐药率达到100%，而氨苄西林／舒巴坦的耐药率也达到83.02%，头孢曲松和头孢唑啉的耐药率均大于95%，氨曲南、头孢他啶和头孢吡肟的耐药率分别为58.49%、35.85%和26.42%，与 ESBLs阴性菌株比较耐药率显著升高（P＜0.05）；按照2008年 CLSI M100－S18标准，ESBLs菌株所有β－内酰胺类抗菌药物均应判定为耐药，自2010年CLSI对折点进行修正后，就提出不必常规进行ESBLs检验，2012年CLSI M100－S22明确指出，采用更新后的折点，不必将头孢菌素类、青霉素类和氨曲南的药敏结果从敏感修正为耐药，实验室检测ESBLs主要用于流行病学调查和医院感染控制［9］。因此，新标准增加了这几类抗菌药物用于临床治疗肠杆菌科细菌的机会，虽然在临床治疗中还存在一定的争议。本研究结果提示，ESBLs仍然是临床抗菌药物选择的一个不容忽视的限制性因素，临床若选择β－内酰胺类抗菌药物治疗ESBLs ECO感染，则需根据MIC值慎重选择敏感抗菌药物，且承担治疗失败的风险加大。鉴于本院ESBLs的高检出率，仍然常规检测和报告ESBLs，既不减少临床抗菌药物选择的机会，又提醒临床需慎重选择。氟喹诺酮类环丙沙星和左氧氟沙星对产ESBLs的ECO菌株耐药率均大于85%，可能与ESBLs基因常与质粒介导喹诺酮耐药基因共存有关，在产ESBLs的ECO中，同时检测到qnr基因携带及gyrA基因和parC基因变异，而这些基因的存在和变异使得细菌对喹诺酮类药物高度耐药［10］。氨基糖苷类妥布霉素和庆大霉素对ESBLs菌株的耐药率达到22.64%和64.15%，而且由于氨基糖苷类的肝肾毒性，限制了该类药物在临床的应用，常常作为联合用药的一部分。本研究结果显示，产ESBLs的ECO呈现对青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类等多种药物的耐药性。ESBLs阴性ECO菌株对大部分抗菌药物均有较高的敏感率，除氨苄西林外，检测的其余抗菌药物的敏感率均大于50%。ESBLs为质粒介导的可通过结合、转化、转导等方式在同种病原菌间甚至不同种病原菌间进行耐药性传播，携带ESBLs菌株可引起医院感染暴发流行。因此，规范抗菌药物的合理应用和监测ESBLs耐药菌的传播和流行应当作为医院感染控制的一个常规性工作。

有研究报道生物被膜菌与游离态细菌相比耐药性大幅度提高，生物被膜是细菌感染难以治愈和反复发作的重要原因［11］。本研究结果提示，96.74%的ECO血液分离菌可以形成生物被膜，而形成被膜的量以中量居多，与文献报道相似［2］。ECO被膜菌耐药性升高与rpoS基因的表达增加密切相关，而rpoS基因又调节一系列与生物被膜形成、黏附、增殖、成熟等各个阶段相关基因的表达，使得被膜菌对抗菌药物的耐药性增强［11］。传统的药敏试验测得的MIC是针对单个游离的细菌，据文献报导，采用被膜菌测得的最小杀菌浓度（BIC）与传统的MIC存在很大差异，两类药敏试验筛选出的敏感抗菌药物也存在很大差异，因此只以MIC指导临床抗菌药物的使用，对生物被膜菌的感染治疗难以达到满意的结果［12］。由于绝大多数ECO菌株均能形成生物被膜，在临床治疗相关感染若依据传统药敏结果疗效不佳时，选择生物被膜敏感的抗菌药物，以提高抗感染治疗的效果。

ECO是目前临床血液标本最常见的分离菌株之一，作为机会致病菌，对ECO特别是ESBLs菌的感染重在预防。高龄、低免疫力和长期住院患者是ESBLs菌的易感对象，长期激素、放化疗和介入治疗是ESBLs菌感染的高危因素。因此，合理使用抗菌药物，减少激素的使用，加强医务人员无菌观念和严格的消毒隔离措施，及时更换或拔除各类导管和合理使用呼吸机等，均有利于预防和减少产ESBLs的ECO的感染和传播。

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Antibiotics susceptibility and ability of biofilm formation of escherichia coli strains isolated from blood specimens

Xiong Jie1，Yang Jiyong2，Zou Ziying1，Zhu Bing1，Wang Lu1，Zeng Ping1
（1.Department of Clinical Laboratory，PLA Chengdu Military Aera Command General Hospital，Chengdu，Sichuan610083，China；2.Department of Microbiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing100853，China）

ObjectiveTo approach the drug resistance of Escherichia coli isolated from blood producing extendedβlactamases（ESBLs）and its ability of biofilm formation，and provide guidance for clinical medication and nosocomial infection control.MethodsEscherichia coli identification and drug sensitivity was detected using Vitek2Compact of biomerieux.The method of microtiter plate culture crystal violet stain was used for quantitative analysis of biofilm formation.ResultsA total of 53（57.61%）Escherichia coli producing ESBLs were isolated from 92Escherichia coli clinical strains.And which didn′t produce ESBLs were 39（42.39%）strains.Escherichia coli that resistant to more than three kinds of antibiotics was 73strains（79.35%），in which 52producing ESBLs（56.52%）.The most resistant antibiotic was ampicillin（94.57%），the next was cefazolin（71.74%）and ampicillin／sulbactam（67.39%）.The resistant rate of ciprofloxacin and levofloxacin was over 60%.The MIC of ESBLs strains of antibiotics often used by clinical including ampicillin／sulbactam，cephems，fluoroquinolones，tobramycin and monobactams was increased significantly compared with ESBLs negative strains.The resistant rate of ESBLs strains compared with ESBLs negative strains increased（P＜0.05）.Cefotetan，nitrofurans，amikacin and gentamicin，piperacillin／tazobactam and carbapenems were susceptible both to ESBLs strains and ESBLs negative strains（P＞0.05）.96.74%of the 92Escherichia coli strains had the ability of biofilm forming，and most isolates formed medium or more quantity of biofilm.ConclusionThe isolating rate of Escherichia coli from blood producing ESBLs was much higher than most hospital that had reported，and having strong ability to form biofilm and resistant to many different kinds of antibiotics.

blood samples；enterotoxigenic；escherichia coli；β－lactamases；biofilms；drug resistance

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.005

A

1671－8348（2012）35－3699－03

2012－06－13

2012－09－12）

·临床研究·