外周血双阴性T细胞升高与临床疾病的关系＊

赵 雪，吴丽娟，刘毓刚

（1.成都军区总医院检验科／成都军区检验医学中心，成都610083；2.四川省达州市中心医院检验科 635000）

外周血双阴性T细胞升高与临床疾病的关系＊

赵 雪1，2，吴丽娟1△，刘毓刚1

（1.成都军区总医院检验科／成都军区检验医学中心，成都610083；2.四川省达州市中心医院检验科 635000）

目的了解外周血双阴性T细胞（DNT）含量升高的临床疾病谱，探讨DNT升高的临床意义。方法回顾性分析2010年1月至2012年2月，收治患者中接受外周血T淋巴细胞亚群检测且DNT升高的病历资料，以临床诊断为金标准，按照疾病分类统计分析。T淋巴细胞亚群检测采用流式细胞学检测技术。结果健康人外周血DNT占淋巴细胞的（7.36±2.13）%，含量达（0.13±0.06）×109／L。送检患者中约有5.45%的外周血DNT增高，主要见于肺部细菌感染、全身性病毒感染、不明原因发热、胸膜炎、急性扁桃体炎、创伤、脑膜炎等。DNT在外周血淋巴细胞中的比例增高和绝对含量增高均以急性扁桃体炎为最高，不明原因的发热次之。增高患者中又以13～17岁青少年患者DNT升幅为最大。结论外周血DNT主要是在临床急性炎症性疾病时明显升高，可能参与了急性感染、严重创伤等患者的细胞免疫调节。

流式细胞术；外周血；双阴性T细胞；疾病谱

双阴性 T细胞（double－negative T－cell，DNT）是淋巴细胞亚群中的一种，免疫学标志为CD3＋CD4－CD8－，因其细胞表面没有CD4、CD8表达而被称为双阴性［1－2］。近年来，由于多色流式细胞分析仪的诞生，DNT细胞的检测成为可能。在日常外周血T淋巴细胞亚群分析中，只要采用CD3－CD4－CD8的三色流式细胞术即可从淋巴细胞群中很容易地将DNT细胞区分出来并加以测定［3］。本文回顾性分析本院近期外周血淋巴细胞亚群检测中DNT异常升高的患者资料，以明确外周血DNT含量的参考范围及其异常升高与临床疾病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年1月至2012年2月，本院临床送验T细胞亚群的病例1 780例，DNT细胞升高97例，其中男72例，女25例，年龄1～77岁，平均28.2岁。对照组63例，为近期健康体检被证实的健康个体，其中男33例，女30例，年龄15～63岁，平均30.5岁。

1.2 标本采集 清晨采集静脉血2～3mL，乙二胺四乙酸二钾（EDTA－2K）抗凝（紫头真空采血管），立即检验。

1.3 流式T细胞亚群的检测 采用双平台三色荧光全血细胞直接染色免洗流式测定法、SSC／FSC设门淋巴细胞，分析总T细胞（CD3＋）、T4细胞（CD3＋CD4＋CD8－）、T8细胞（CD3＋CD4－CD8＋）、DNT（CD3＋CD4－CD8－）百分含量和绝对含量，计算T4／T8细胞比值。全部试剂如同型对照抗体IgG1－FITC／IgG1－PE／IgG1－PC5，测 定 抗 体 CD4－FITC／CD8－PE／CD3－PC5、标本预处理试剂等均为美国Beckman－Coulter公司产品，仪器采用Beckman－Coulter XL4－MCL型流式细胞仪。具体检测方法参照文献［3］进行。

1.4 诊断标准 以对照组DNT细胞百分含量和绝对含量的（＋2s）为临界值，大于该水平即被认为增高。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析，计量资料以±s表示，计量资料组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外周血DNT增高的疾病分布 1 780例患者中DNT增高97例，增高率5.45%。97例DNT增高患者中临床资料齐全的共54例，包括肺部细菌感染14例（26.4%），全身性病毒感染11例（20.8%），不明原因发热6例（11.3%），胸膜炎6例（11.3%），急性扁桃体炎5例（9.4%），创伤3例（5.6%），脑膜炎2例（3.7%），溃疡性结肠炎1例（1.9%），退行性脊椎炎1例（1.9%），椎间盘突出1例（1.9%），气胸1例（1.9%），慢性肾功能不全1例（1.9%），高血压1例（1.9%），白内障1例（1.9%）。2.2 DNT增高患者的外周血DNT水平 DNT在外周血淋巴细胞中的比例以急性扁桃体炎患者最高，约占淋巴细胞的1／2；其次是不明原因的发热患者，约占淋巴细胞的1／4；其余依次是肺部细菌感染、全身性病毒感染、胸膜炎和创伤。DNT绝对含量以急性扁桃体炎患者最高，其余依次是不明原因的发热患者、创伤、肺部细菌感染、全身性病毒感染、胸膜炎，见表1。

表1 外周血DNT增高患者的流式检测结果（±s）

表1 外周血DNT增高患者的流式检测结果（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与对照组比较。

组别 n 绝对含量（×109／L）对照组63 0.13±0.06肺部细菌感染组 14 0.27±0.26b全身性病毒感染组 11 0.21±0.15b不明原因发热组 6 0.82±1.30b胸膜炎组 6 0.19±0.05a急性扁桃体炎组 5 2.68±1.36b创伤组 3 0.29±0.05a其他疾病组 9 0.25±0.13a

2.3 外周血DNT增高与患者年龄的关系 将97例外周血DNT增高患者按照年龄进行分组。数据显示13～17岁青少年人群DNT升幅最大，DNT平均可增高到占淋巴细胞的1／3以上，绝对含量可增加一个数量级，结果见表2。

表2 不同年龄外周血DNT细胞含量升高水平（±s）

表2 不同年龄外周血DNT细胞含量升高水平（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与0～3岁组比较；c：P＜0.05，d：P＜0.01，与4～12岁组比较；e：P＜0.05，f：P＜0.01，与13～17岁组比较。

年龄组 n 绝对含量（×109／L）0～3岁组 12 0.89±1.01e 4～12岁组 23 0.53±0.59f 13～17岁组 7 2.07±1.79bd 18～60岁组 48 0.24±0.16af＞60组 7 0.18±0.06af

3 讨 论

正常情况下，T细胞占淋巴细胞总数的65%以上，是人类最重要的免疫效应细胞。T细胞（CD3＋淋巴细胞）包括T4细胞（CD3＋CD4＋CD8－，也称 CD4＋T 细胞）、T8细胞（CD3＋CD4－CD8＋，也称CD8＋T细胞）、DNT（CD3＋CD4－CD8－）和双阳性T细胞（CD3＋CD4＋CD8＋，简称DPT）等亚群［3－4］。Fischer等［5］采用密度梯度离心法分离了20例健康人的外周血单个核细胞，以CD3、CD4、CD8、TCRαβ、TCRγδ荧光标记抗体染色，用流式细胞仪对其中的DNT进行了分析，结果发现DNT占CD3＋细胞的4.1%（1.9%～7.7%）。对这些DNT的进一步鉴定证实，健康人外周血中的DNT细胞主要表达TCRγδ（平均3.2%，范围2.1%～3.6%），TCRαβ＋的 DNT细胞仅占0.9%（0.4%～1.9%）。上述结果表明，健康人外周血中是存在一定数量的DNT细胞的。本实验室2005年采用全血细胞直接染色免洗流式测定法，对200例健康人进行了外周血DNT含量调查，结果显示健康人外周血中DNT的百分含量占淋巴细胞的12.33%以内，绝对含量达到（0.24～1.08）×109／L水平［3］。之后立即在流式细胞术外周血T细胞亚群检测中向临床回报DNT百分含量和绝对含量检测结果。本研究对本院近一段时间临床标本中DNT含量增高的患者进行了调查分析，同样证实健康人外周血中含有（7.36±2.13）%、（0.13±0.06）×109／L的 DNT；发现在临床送验的各种疾病患者的外周血样中大约有5.45%的患者存在DNT增高的情况，其中主要是肺部细菌感染、全身性病毒感染、不明原因发热、胸膜炎、急性扁桃体炎等；急性扁桃体炎时，外周血DNT甚至可以占到淋巴细胞的一半以上，每升全血中的DNT含量可以达到109水平；并且发现在13～17岁年龄阶段的患者，其DNT增高的幅度最大。本研究与Fischer K等［5］的报道在数值上存在一定差异，这可能与采取的方法以及观察对象人种不同有关。采用传统方法在单个核细胞提取时可能造成部分DNT丢失，而染色后的洗涤过程可能引起荧光抗体的部分脱落，导致检验结果偏低。因此，笔者推荐外周血淋巴细胞亚群分析应尽量采取新一代全血细胞直接染色免洗流式测定法，其检测结果更为准确。

外周血DNT细胞的来源目前尚不清楚。有学者以鼠为动物模型研究提示，DNT可能来自CD8＋T细胞的前体细胞［6］，但是 MacDonald［7］则认为 DNT 细胞有自己独特的分化途径并非依赖CD8＋细胞，肯定存在一种胸腺分化外途径。Zhang等［8］发现存在αβ－TCR＋、CD3＋、CD4－、CD8－、CD25＋、CD28－、CD44－、NK1.1－这样一群独特的DNT细胞，也提示可能存在胸腺以外的形成途径。

在功能方面，目前已证实DNT细胞能够抑制具有相同T细胞受体的CD8＋T细胞和CD4＋T细胞的功能［1］。Strober等［9］首次发现αβ－TCR＋双阴性NKT细胞具有抑制功能并诱导免疫耐受，随后Johansson等［10］在转基因小鼠体内分离出无反应性的NK1.1－DN T细胞。也有学者报道人类DNT细胞具有一定的抑制性免疫调节功能［11］。本研究显示，外周血DNT升高主要见于临床炎症性疾病，包括感染性和非感染性疾病，结合上述国外研究成果，笔者推测炎症性疾病时外周血DNT增高可能参与了对体内T4、T8细胞功能的调节，通过对过高T4或T8细胞应答的抑制来预防体内细胞免疫应答的过度亢进，防止过度免疫反应对机体造成免疫损伤。基于上述推测，笔者认为青少年患者外周血DNT细胞增高的幅度远远大于其他年龄段患者的情况，是因为青少年人群T细胞发育已经完全成熟，且T细胞的功能正值旺盛时期，机体遭遇外来抗原刺激时其反应性强于低龄段和高龄段人群的T细胞，因此需要更多的DNT细胞来平衡强烈的T细胞应答。

因此，检测外周血DNT十分重要，它是急性感染、严重创伤等患者体内的免疫功能状态、病情监测的一个新指标。进一步开展有关外周血DNT来源、特性、功能、表达及激活机制的研究，或许能探索出一条崭新的临床治疗路径，推动未来相关疾病的免疫治疗。

［1］Naito T，Tanaka H，Naoe Y，et al.Transcription control of T－cell development［J］.Int Immunol，2011，23（11）：661－668.

［2］Lev A，Simon AJ，Amariglio N，et al.Hymic functions and gene expression profile distinct double－negative cells from single positive cells in the autoimmune lymphoproliferative syndrome［J］.Autoimmun Rev，2012，11（10）：723－730.

［3］吴丽娟.临床流式细胞学检验技术［M］.北京：人民军医出版社，2010：78－88.

［4］窦肇华，张远强，郭顺根.免疫细胞与疾病［M］.北京：中国医药科技出版社，2004：1－127.

［5］Fischer K，Voelkl S，Heymann J，et al.Isolation and characterization of human antigen－specific TCR αβ＋CD4－CD8－double－negative regulatory T cells［J］.Blood，2005，105（7）：2828－2835.

［6］Zhang ZX，Yong KJ，Zhang L.CD3＋CD4－CD8－αβ－T cell as immune regulatory cell［J］.J Mol Med（Berl），2001，79（8）：419－427.

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［9］Strober S，Cheng L，Zeng D，et al.Double negative（CD4－CD8－alpha beta＋）T cells which promote tolerance induction and regulate autoimmunity［J］.Immunol Rev，1996，149（1）：217－230.

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［11］张竹虚，张丽.αβ－TCR＋CD3＋CD4－CD8－双阴性 T细胞：一种新发现的免疫调节T细胞［J］.现代免疫学，2004，24（1）：5－8.

The relationship between the increase of double negative T cell in peripheral blood and clinical disease＊

Zhao Xue1，2，Wu Lijuan1△，Liu Yugang1
（1.Department of Medical Laboratory，Chengdu Military General Hospital，Chengdu，Sichuan610083，China；2.Department of Medical Laboratory，Dazhou Central Hospital，Dazhou，Sichuan635000，China）

ObjectiveTo analyze the clinical spectrums of disease of abnormal elevation of double negative T cells in peripheral blood，and identify the clinical significance of double negative T cells（DNT）increase.MethodsWe did a retrospective analysis of the medical data of patients who were DNT increased in peripheral blood obtained from January 2010to February 2012.Our research set clinical diagnosis as gold standard and we conducted the statistical analysis in accordance with the classification of diseases.T lymphocyte subsets were assessed by flow cytometry.ResultsThe DNT percentage and absolute quantity was（7.36±2.13）%and（0.13±0.06）×109／L in healthy people.There were about 5.45%patients had an increased DNT levels in all delivered T cell subset examination patients.DNT increasing in peripheral blood mainly found in pneumonic bacterial infection，general viral infection，innubibus fever，pleuritis，acute tonsillitis，trauma and cephalomeningitis，etc.Acute tonsillitis patients had the highest percentage and absolute quantity increase of DNT，followed by innubibus fever.In addition，adolescents aged 13to 17had the highest increase of DNT.ConclusionDNT were significantly increased in peripheral blood of acute inflammation patients，and it maybe take part in regulating cell immunity in patients with acute infection，severe trauma，etc.

flow cytometry；peripheral blood；double negative T cell；disease spectrum

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.006

A

1671－8348（2012）35－3702－02

四川省科技厅基金资助项目（2011JY0037）。 △

，Tel：（028）86571052；E－mail：wulijuan1638＠126.com。

2012－06－09

2012－08－22）

·临床研究·