还原型谷胱甘肽对大鼠急性肺损伤的保护作用

刘振威 李玉霞 方阅a 高风英

（1.上海交通大学附属第一人民医院呼吸科，a药剂科，上海 200080；2.上海市建工医院呼吸科，上海 200083）

失血性休克时发生的急性肺损伤（acute lung injury，ALI）严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），威胁患者的生命。目前，还原型谷胱甘肽已被广泛用应于心肌梗死、脑缺血和急性脑损伤等的治疗[1]。但是，还原型谷胱甘肽对ALI是否具有保护作用，尚鲜见相关文献报道。本研究通过建立失血性休克的大鼠模型，造成ALI，复苏时应用还原型谷胱甘肽，然后检测大鼠动脉血浆中肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和肺组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量以及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophages，PAM）、中 性 粒 细 胞 （polymorphonuclear leukocytes，PMN）总数和蛋白质含量，并观察肺组织含水率、组织形态学等指标的变化，探讨还原型谷胱甘肽对ALI的保护作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物 取健康SD大鼠（复旦大学上海医学院动物中心）24只，体质量（276.5±1.5）g，雌雄各半。

1.2 试剂与药品 TNF-α测定试剂盒（中国人民解放军第四军医大学免疫学教研室，批号20110113）；SOD测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20110108）；还原型谷胱甘肽（北京协和药厂，批号20040223，每支600 mg）。

1.3 仪器 AXSYM全自动酶免分析仪（美国雅培公司）；AU640全自动生化分析仪（日本奥林帕斯公司）；SF23000全自动血球计数仪（日本东亚公司）；ML780型MacLab生理记录仪（澳大利亚ADI公司）；DX51光学显微镜（日本奥林帕斯公司）；H27500透射电镜（日本东芝株式会社）。

1.4 研究方法

1.4.1 失血性休克SD大鼠模型的建立 按照Wiggers改良法建立失血性休克模型[2]。通过三通接头连接生理记录仪，记录平均动脉压（MAP）和心率（HR）。

1.4.2 实验分组 将24只大鼠随机分为假手术组、模型对照组和研究组，每组8只，试验前12 h禁食、禁饮。失血性休克后复苏时，模型对照组静脉滴注0.9%氯化钠液，1.5 mL／kg；研究组静脉滴注还原型谷胱甘肽，40 mg／kg；假手术组只进行手术操作，不建立休克模型，并静脉滴注0.9%氯化钠液，1.5 mL／kg。

1.5 观察指标

1.5.1 TNF-α含量 于大鼠休克前、休克90 min、复苏1 h末、复苏3h末，分别经股动脉取血1 mL，离心后分离血浆，－70℃保存，按照TNF-α测定试剂盒说明书操作。

1.5.2 BALF中PAM、PMN和蛋白含量 实验结束即刻，迅速剖胸取左肺，用0～4℃0.9%氯化钠液8 mL灌洗支气管和肺，灌洗5次，并收集灌洗液。甲紫染色后计数BALF中吞噬细胞总数；用瑞氏液染色计数PAM和PMN，计算百分率，将百分率乘以细胞总数即得到细胞的绝对数。将BALF以1500 r／min离心5 min，取上清液用考马斯亮兰法测定其中蛋白含量。

1.5.3 SOD含量 取肺组织匀浆，按试剂盒说明书操作。

1.5.4 肺组织含水率 含水率＝（湿质量－干质量）／湿质量×100%，计算肺组织的含水率。

1.5.5 形态学观察 在光镜下观察肺组织形态学变化。

1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0软件包进行统计学分析。全部数据采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血浆TNF-α含量的变化 休克前3组大鼠TNF-α含量见表1。

2.2 BALF中细胞数量、蛋白含量的变化 见表2。

表1 3组血浆TNF－α含量比较（ng／L）

表2 3组BALF中细胞数量和蛋白含量比较

2.3 肺组织SOD含量、含水率的比较 见表3。

表3 3组复苏后肺组织SOD含量和含水率比较（，n＝8）

表3 3组复苏后肺组织SOD含量和含水率比较（，n＝8）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，b P＜0.01

组别 n SOD含量（nU／mg） 含水率（%）假手术组 8 7.37±0.38 70.23±1.90模型对照组 8 4.01±0.34a 79.45±0.99a研究组 8 6.35±0.12b 75.09±0.96b

2.4 肺组织形态学观察 光镜下可见假手术组肺组织的肺泡壁薄，相邻肺泡仅隔以薄层间质；模型对照组肺组织间质增厚，粒细胞浸润，部分区域呈肺不张状态；研究组肺组织间质增厚以及粒细胞浸润的程度显著轻于模型对照组。

3 讨 论

Bhetia等[2]研究证实，体内 TNF－α水平的升高是失血性休克导致ALI的重要因素，而且其升高程度与ARDS的发生有一定的相关性。本研究显示，SD大鼠失血性休克后血浆TNF－α含量持续升高，以复苏后3 h最为明显；应用还原型谷胱甘肽后，血浆TNF-α升高幅度降低，提示还原型谷胱甘肽在一定程度上抑制了TNF－α的合成或释放，进而对肺损伤起到保护作用。本研究中假手术组的TNF－α含量也出现小幅度上升，可能因手术操作使局部组织损伤所致。Bhatia等[2]研究认为，PMN在肺泡腔的大量积聚是ALI的特征性变化，检测BALF中的PMN数量可以直接反映PMN浸润的程度。肺毛细血管通透性增高是肺损伤后的基本病理改变，表现为血管中水和蛋白漏出血管壁，故测定BALF中的蛋白含量以及肺组织含水量可在一定程度上反映肺血管内皮细胞的损伤。本研究发现，复苏后模型对照组、研究组肺组织BALF中PMN的数量、蛋白含量、含水率高于假手术组，表明失血性休克导致了肺水肿等ALI的表现，这与光镜下观察到的肺间质增宽、粒细胞浸润等组织学变化相符；还原型谷胱甘肽能够显著改善肺水肿。SOD可以清除氧自由基，保护细胞免受损伤。应用氧自由基清除剂可以降低多器官功能衰竭的发生率[3－4]。测定SOD活力可反映组织抗氧化能力。本研究中，模型对照组肺组织中SOD活力较假手术组低，提示肺损伤过程中自由基清除不足，故组织细胞损伤较重。

综上所述，还原型谷胱甘肽因能够抑制ALI时血浆TNF-α含量的升高，减轻PMN浸润，清除氧自由基，减轻肺组织水肿程度，从而对ALI起到有效的保护作用。

[1]Wu J，Ferrance JP，Landers JP，et al.Integration of a preco lumn fluorogenic reaction，separation，and detection of reduced glutathione[J].Anal Chem，2010，82（17）：7267-7273.

[2]Bhatia M，Zemans RL，Jeyaseelan S，et al.Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2012，46（5）：566-572.

[3]Alastair G，Proudfoot，Danny F，et al.Human models of acute lung injury[J].Dis Model Mech，2011，4（2）：145-153.

[4]Perl M，Lomas-Neira J，Venet F，et al.Pathogenesis of indirect（secondary）acute lung injury[J].Expert Rev Respir Med，2011，5（1）：115-126.