靶向mTOR siRNA的合成及对MCF-7细胞mTOR基因表达的影响

张岳灿，翟娜娜

1)宁波天一职业技术学院人体形态学教研室 宁波 315104

2)黄河科技学院人体解剖学与组织胚胎学教研室 郑州 450052

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指小分子双链RNA转录后沉默靶基因的表达。siRNA主要通过特异地与序列互补的mRNA结合，并促进其降解，从而在细胞内发挥基因抑制的作用，最终使靶向基因表达下调。RNAi因其可以高效、特异地抑制靶基因的表达而迅速成为一种非常有效的在真核细胞中研究基因功能的工具，目前已经广泛地应用于基因功能鉴定、基因表达转录后调控等热门研究领域，同时也为多种疾病特别是肿瘤的基因治疗提供了新的思路[1]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种重要的信号转导分子，其在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键作用[2]。近年来研究[3-7]发现，mTOR 途径在肿瘤细胞生长的调节中发挥重要作用，mTOR信号通路调节异常与包括乳癌在内的多种肿瘤的形成、细胞恶性转化相关，已成为肿瘤治疗的新靶点。作者设计了靶向mTOR的 siRNA，并观察其对人乳癌 MCF-7细胞mTOR蛋白及mRNA表达的沉默作用。

1 材料与方法

1.1 材料 MCF-7细胞系由河南省医药科学研究所王庆端研究员惠赠;RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司;T7 RiboMAXTMExpress RNAi System、SA-AP、BCIP/NBT购自美国 Promega公司;LipofectamineTM2000脂质体购自上海杰美基因医药科技有限公司;mTOR鼠抗人多克隆抗体购自美国SAB公司;siRNA模板及5’端生物素标记mTOR cDNA探针(5’-CTCAGCGGTAAAAGTGTCCCCTGCCA-3’)由北京奥科生物技术有限责任公司合成;免疫细胞化学染色SP试剂盒、胃蛋白酶、预杂交液购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 靶向mTOR siRNA的合成 根据已知Gen-Bank mTOR mRNA序列和siRNA的设计原则[4]，利用Promega公司的在线设计寻找靶序列，并针对mTOR基因的434～452位点设计合成寡核苷酸模板，序列见表1。按T7 RiboMAX Express RNAi System说明书操作。将各模板的oligo-1和oligo-2、oligo-3和oligo-4分别互补成DNA双链，2条双链DNA分别转录产生siRNA的正义链和反义链，退火后可得到双链siRNA，经纯化后重悬于无RNase的水中，以20 bp DNA Ladder为参照，琼脂糖凝胶电泳，－80℃保存备用。同时设计合成无义模板，按如上操作得到siRNA-N。

表1 靶向mTOR siRNA转录模板序列

1.3 细胞培养及转染 将MCF-7细胞培养于RPMI 1640培养液(含体积分数10%胎牛血清，青霉素100 mg/L，链霉素 100 mg/L)中，37℃、体积分数5%CO2孵箱内培养。取对数生长期细胞用无抗生素培养液培养，待细胞达80% ～90%融合时分组转染，分别转染100和150 nmol/L的 siRNA、siRNAN，正常对照组不转染。严格按LipofectamineTM2000试剂说明书进行操作。转染24、48和72 h时，收集细胞并调整细胞浓度为 1 ×106mL－1，以 20 μL/片将细胞悬液滴于预处理的载玻片中央，固定备用。

1.4 mTOR蛋白的检测 取对数生长期细胞，严格按照免疫细胞化学染色试剂盒说明书操作。以已知mTOR蛋白阳性表达的食管癌组织作阳性对照[8];以PBS代替一抗作阴性对照。mTOR蛋白阳性信号呈棕黄色颗粒样物质，位于胞质内。

1.5 mTOR mRNA的检测 取对数生长期细胞，经乙醇脱水处理后用体积分数30%H2O21份加纯甲醇50份混匀灭活内源性过氧化物酶，Triton X-100/PBS进行透膜，然后用多聚甲醛及 PBS(pH 7.2～7.6，含有1/1000 DEPC) 暴露mRNA 核酸片段。预杂交:滴加20 μL/片杂交液，置湿盒内，42℃预杂交3～4 h。杂交:滴加含标记cDNA探针(0.3～0.6 mg/L)的杂交液于标本上，然后覆盖蜡膜，42～43℃杂交12～16 h。杂交后处理:在42℃下应用0.1×SSC洗标本15 min×4次，以洗脱非特异性杂交。用SA-AP和BCIP/NBT进行杂交后显色。以杂交前用RNase处理的样本作阴性对照，用已知的mTOR mRNA阳性表达的食管癌组织作阳性对照[8]。mTOR原位杂交阳性信号定位于胞质中，呈蓝紫色，阳性对照均有阳性信号显示，阴性对照均无阳性信号显示。

1.6 结果判定 免疫细胞化学及原位杂交结果判定方法为:观察10个高倍视野，按阳性细胞数≤10%、≤30%、≤70%和＞70%分别记为1、2、3和4分。按着色强度:胞质内可见浅色颗粒，明显高于背景底色计为1分;胞质内见较深色颗粒计为2分;胞质内有大量深色颗粒为3分。上述两种计分的乘积为最后得分。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.0进行统计分析，4组3个时间点间MCF-1细胞mTOR蛋白和mRNA表达水平的比较应用4×3析因设计的方差分析，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 4组细胞 mTOR蛋白的表达 见图1、表2。与siRNA-N转染组和正常对照组比较，mTOR siRNA转染组细胞mTOR蛋白的表达均有所降低，但2个mTOR siRNA转染组之间差异无统计学意义;各组细胞mTOR蛋白表达水平未随转染时间的延长而有所变化。

图1 转染72 h后各组细胞mTOR蛋白的表达(SP，×400)

表2 4组细胞mTOR蛋白表达水平的比较

2.2 4组细胞 mTOR mRNA的表达 见图2、表3。与siRNA-N转染组和正常对照组比较，mTOR siRNA转染组细胞mTOR mRNA的表达均有所降低，但2个mTOR siRNA转染组之间差异无统计学意义;各组细胞mTOR mRNA表达水平未随转染时间的延长而有所变化。

图2 转染72 h后各组细胞mTOR mRNA的表达(ISH，×400)

表3 4组细胞mTOR mRNA表达水平的比较

3 讨论

研究[2]表明mTOR是PI3K/AKT/mTOR信号通路下游的重要效应蛋白，它可接收整合生长因子、营养、能量等多种信号，通过PI3K/AKT途径或AMPK途径来发挥作用，是调节细胞生长和增殖的中心环节。mTOR还能调控c-myc、cyclinD等多种癌基因的表达，这些过程都与肿瘤的发生密切相关。现已发现[9-10]，大多数恶性肿瘤，如非小细胞性肺癌、肾细胞癌、白血病、鼻咽癌、喉癌、肝细胞癌及前列腺癌等，均伴有mTOR信号通路的调控异常，mTOR信号通路中的相关激酶大都处于激活状态，这些激酶的激活原因很多，包括PTEN功能缺失、Akt扩增及结节性硬化复合物突变缺失等。mTOR抑制剂雷帕霉素在体内外均可特异性地阻断mTOR/p70S6K信号通路，下调mTOR的表达并抑制p70S6K和4EBPI的磷酸化，使细胞周期停滞在G1期，抑制癌细胞的增殖，促进其凋亡[11]。由此可见mTOR信号通路在肿瘤的形成和发展中扮演着重要角色，并参与肿瘤的浸润和转移[9]。Zhou 等[12]的研究发现，mTOR的表达水平从正常乳腺上皮组织、不典型增生到恶性转化再到肿瘤浸润渐次增加。

作者设计并体外转录合成靶向mTOR siRNA，转染人乳癌MCF-7细胞后，运用免疫细胞化学SP法和原位杂交技术检测细胞mTOR蛋白及mRNA的表达情况。结果显示，靶向mTOR siRNA处理的MCF-7细胞mTOR蛋白和mRNA的表达均较正常对照组明显降低。说明该研究中制备的mTOR siRNA可有效抑制乳癌MCF-7细胞mTOR蛋白及mRNA的表达，这为深入研究乳癌的发生发展机制以及肿瘤靶向治疗积累了实验资料。

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