蒸汽爆破甘蔗渣中抗氧化物质的提取及评价

李晶博，林蒋海，肖文娟，刘泽寰

(暨南大学生命与健康工程研究院分子生物研究中心，广东广州510632)

蒸汽爆破甘蔗渣中抗氧化物质的提取及评价

李晶博，林蒋海，肖文娟，刘泽寰*

(暨南大学生命与健康工程研究院分子生物研究中心，广东广州510632)

以蒸汽爆破甘蔗渣(SESB)为原料，乙醇、甲醇、水及乙酸乙酯为溶剂，对其中的多酚和糖进行提取并评价了提取液的抗氧化能力。其中甲醇提取液中酚类物质含量最高((1.5174±0.0140)mg/mL)，水次之((1.2382±0.0025)mg/ mL)，乙酸乙酯最低。提取液中的总糖含量以水中最多，其次为甲醇，乙酸乙酯中最低。四种提取液对DPPH自由基均具有很强的清除能力。水、乙醇和甲醇提取液具有较强的还原力，呈明显的量效关系。采用溶剂对SESB中抗氧化物质提取是可行的。综合经济效益、环境问题及水提取液中酚类含量、总糖含量以及抗氧化能力，认为以水作为溶剂最佳。

蒸汽爆破甘蔗渣，酚类，总糖，提取，抗氧化能力

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蒸汽爆破甘蔗渣(SESB) 河南省鹤壁市正道重机厂，蒸汽爆破参数:温度:220℃;液固比:1∶1;220℃保温时间:5min;无水乙醇(AR) 南京化学试剂厂;乙酸乙酯(AR) 国药化学集团;甲醇(AR) 天津大茂化学试剂厂;浓硫酸(AR) 北京化工厂;木糖(BR) 上海博澳生物科技有限公司;没食子酸(AR) 天津光复精细化学研究所;Folin－Ciocalteu试剂 广州齐云生物技术有限公司;DPPH 日本东京化成工业株式会社;实验用水为Millipore超纯水;其余试剂 均为分析纯。

UNICO UV－2000紫外可见光分光光度计 尤尼克(上海)仪器有限公司;恒温水浴锅 金坛实验仪器设备厂;超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司。

表1 不同提取液中总糖、酚类含量Table 1 Total sugar and phenolic contents in different extracts

1.2 实验方法

1.2.1 SESB中酚类物质的提取 精确称取0.5g绝干SESB置于具塞刻度试管中，分别精确加入10mL去离子水、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯溶液，分别于100、80、80、80℃提取10min，然后自来水冷却，过滤后分别得到水提取液(AE)，乙醇提取液(EE)，甲醇提取液(ME)，乙酸乙酯提取液(EAE)。

1.2.2 Folin－Ciocalteu法测定酚类物质测定波长的选择 准确称量0.1g没食子酸，溶于100mL去离子水中，得到1mg/mL没食子酸溶液。然后准确取10mL 1mg/mL没食子酸溶液，用去离子水定容至100mL，得到0.1mg/mL没食子酸标准液。取该溶液0.3mL置于10mL比色管中，加去离子水定容至5mL，摇匀，加入0.5mL Folin－Ciocalteu试剂，摇匀后，加入0.75mL 20%的Na2CO3溶液，定容至刻度，同时做空白管。40℃水浴40min后，在700～900nm范围内测定吸光度，确定最大吸收波长。取一定量的AE溶液，依上法显色后，在700～900nm范围内测定吸光度。

1.2.3 Folin－Ciocalteu法测定酚类物质含量的标准曲线建立 用刻度吸管精确量取0.1mg/mL没食子酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，根据1.2.2方法显色后，于选定波长下测定其吸光度，得到回归标准曲线。

1.2.4 Folin－Ciocalteu法测定酚类物质含量的方法精密度 取等量的AE、EE、ME、EAE，分别测定五次，计算平均值及相对标准方差(RSD)。

1.2.5 Folin－Ciocalteu法测定酚类物质含量的加样回收率 取已知量的AE、EE、ME、EAE，分别加入标样40μg，然后测定，计算回收率和RSD。

1.2.6 提取液中酚类物质含量测定 根据测定结果利用回归曲线计算得到。

1.2.7 DPPH自由基清除率的测定 根据文献［6］进行测定。IC50表示清除率为50%时的酚类物质含量。

1.2.8 还原力测定 根据文献［7］进行测定。OD700越高说明还原力越强。

1.2.9 总糖测定 根据文献［8］进行测定，以木糖作为标准品，在480nm处进行测定。

2 结果与讨论

2.1 Folin-Ciocalteu法测定酚类物质含量的方法学验证

不同文献报道的采用Folin－Ciocalteu法测定酚类物质所选的波长都不尽相同［9－10］，而且由于不同底物引起的检测方法适用性差异，本文对 Folin－Ciocalteu法测定SESB不同提取液中的酚类物质进行了验证。因此在本实验中，分别对没食子酸标准品和样品显色液在不同波长下进行了测定，本实验选择765nm作为测定波长。Folin－Ciocalteu法测定不同溶剂提取液中酚类物质测定的精密度，其RSD值均小于5%，说明采用该方法测定AE、EE、ME、EAE中酚类物质具有较高的精密度。采用 Folin－Ciocalteu法测定不同溶剂提取液中酚类物质的加样回收率均在100%±5%之间，说明该方法具有较好的准确性。加样回收率之间的RSD均小于5%，说明该法的重现性高(数据均未显示)。

2.2 不同提取液中的总糖、酚类含量

有研究表明，从麦麸中提取的阿魏酸寡聚糖具有一定的抗氧化能力［11］，因此，本实验对提取液中的总糖进行了测定。表1中列出了提取液中的总糖、总酚含量。乙酸乙酯提取液中的总糖低于检限，而其他三种溶剂中的总糖含量由高到低排列:水、甲醇、乙醇，并且两两之间具有显著性差异，说明用水、甲醇和乙醇作为溶剂提取SESB中抗氧化组分时，部分糖会溶解于其中。虽然这部分糖由于被提取而会降低同步糖化共发酵产乙醇的产量，但其脱毒作用以及所得到的抗氧化组分可以弥补其不足，并且提取的糖分有可能为低聚木糖等高附加值产品。

水、乙醇和甲醇提取液中的酚类物质含量相差不大，但是乙酸乙酯提取液中酚类物质的含量较其他三种溶剂少约10～14倍。虽然很多研究［4，12］采用乙酸乙酯提取酚类物质，然而本实验结果表明乙酸乙酯并不是酚类物质的最佳溶剂，这与Goli等［13］的报道一致。由表1可知，甲醇提取液中酚类物质含量最高，其次为水提取液，乙醇提取液次之，乙酸乙酯提取液中酚类物质含量最少。

2.3 不同溶剂提取液的DPPH清除能力

DPPH是一种稳定的自由基，当其与具有自由基清除能力的化合物混合时，颜色由紫色变为黄色，因此，DPPH·作为评价物质自由基清除能力的一种常用自由基而被广泛应用［14］。很多有自由基清除潜力的物质都能够使DPPH自由基褪色，包括溶剂中的杂质甚至自身可以作为自由基清除者［15］，因而DPPH测定系统评价了混合物中总的自由基清除能力。

图1－A表示了三种不同溶剂提取液在不同体积下的DPPH自由基的清除能力。EE、ME和AE的体积在20μL时，其DPPH·清除率和加入的提取液体积具有较明显的线性关系，R2分别为:0.9707、0.9937、0.9868，说明提取液的DPPH·清除率在小于85%时具有明显的量效关系，当提取液的体积超过20μL时，其DPPH·清除率趋于稳定。EE、ME和AE的DPPH·清除能力十分接近，在体积为30μL和40μL时达到最大值，90%左右。而乙酸乙酯提取液在25μL时仅具有22.42%的清除率(图1－B)。由此可见，对于SESB中抗氧化物质的提取，极性较强的溶剂(乙醇、甲醇和水)的提取效果较好，其他研究［13］具有类似的结果。

图1 不同溶剂提取液的DPPH·清除率Fig.1 DPPH·scavenging ability of different solvent extracts

IC50是指DPPH自由基清除率达到50%时的酚类物质浓度，水、乙醇、甲醇和乙酸乙酯提取液中抗氧化物质的 IC50依次为:5.9720、4.4535、6.2373和5.1341mg GAE/L。IC50越高表明此提取液的DPPH·清除能力越差［16］。乙醇提取液的IC50最小，甲醇的最大。说明乙醇提取液中DPPH·清除能力较强的组分较多，而甲醇对于DPPH·清除能力较强的组分溶解能力较差。由于溶液极性的不同，对酚类物质中不同组分的溶解能力也不尽相同，不同组分的DPPH·清除能力也不尽相同［17］。

2.4 不同溶剂提取液的还原力

还原力可以作为抗氧化能力的一个重要反映，还原力高则表明抗氧化能力强［5］。由图2可以看出，不同体积的提取液均具有较强的还原力，由于乙酸乙酯提取液中酚类含量太低，未对其进行检测。水提取液的还原力较其他两种提取液的还原力弱(P＜0.05)，而乙醇和甲醇提取液的还原力在20～100μL时几乎没有差异(P＞0.05)。在测定范围内，三种不同提取液均表现出较强的量效关系，将其加入量和OD700进行线性回归，得到:水提取液R2=0.9981，乙醇取液R2=0.9947，甲醇提取液R2=0.9994。

3 结论

采用不同溶剂从蒸汽爆破甘蔗渣中提取酚类物质是可行的。结果表明，乙醇、甲醇和乙酸乙酯对于Folin－Ciocalteu法测定酚类物质没有干扰，均具有较高的精密度和加样回收率。经测定，以甲醇提取液中的酚类物质含量最大，为(1.5174±0.0140)mg/mL;水提取液中的酚类物质含量次之，为(1.2382±0.0025) mg/mL;以乙酸乙酯提取液中的酚类物质含量最小，为(0.1110±0.0009)mg/mL。DPPH自由基清除能力和还原力表明，水提取液与甲醇、乙醇提取液均具有较强的抗氧化能力且相差不大，均具有一定的量效关系。水提取液中的糖含量较大，此部分可能为半纤维素降解得到的木糖、低聚木糖和木聚糖，进一步的研究将对其成分进行分析、分离纯化。综上可得出如下结论:采用乙醇、甲醇和水对蒸汽爆破甘蔗渣中的酚类物质进行提取是可行的。而且乙醇和水对蒸汽爆破甘蔗渣具有脱毒作用［18－19］。考虑到经济效益、环境问题及水提取液中酚类含量、总糖含量以及抗氧化能力，认为以水作为蒸汽爆破甘蔗渣中酚类物质提取的溶剂最为合理。

图2 不同溶剂提取液的还原力Fig.2 Reducing power of different solvent extracts

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Extraction and evaluation of antioxidants from steam exploded sugarcane bagasse

LI Jing－bo，LIN Jiang－hai，XIAO Wen－juan，LIU Ze－huan*
(Research Center for Molecular Biology，Institutes of Life and Health Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Solvents(ethanol，methanol，water and ethyl acetate)were used to extract the phenols and sugars from the steam exploded sugarcane bagasse(SESB)and the evaluation of their antioxidant activity was conducted.The result showed that phenolic content in methanol－extract was the highest，about(1.5174±0.0140)mg/mL and followed by aqueous－extract，(1.2382±0.0025)mg/mL，while the lowest in ethyl acetate，about(0.1110±0.0009) mg/mL.The sugar content in aqueous extract was the highest and followed by methanol extract and also was lowest in ethyl acetate.Moreover，strong DPPH radical scavenging ability was found in the four extracts.Reducing power of three of them were not only very strong but also presented a dose－dependent manner in a certain scale of concentration.The conclusion could be drawn that extraction of antioxidative compounds from SESB using water was a feasible way to obtain antioxidants when considered economic and environmental factor.

steam exploded sugarcane bagasse;phenol;total sugar;extraction;antioxidant activity

TS255.1

A

1002－0306(2012)10－0105－04

甘蔗渣是甘蔗制糖工业的下脚料，主要成分为木质纤维素，可以经过预处理、酶水解以及发酵制备燃料乙醇。然而，木质纤维素具有天然的抗生物降解能力，因此，在木质纤维素生物转化之前，预处理对于纤维素乙醇的生物转化十分必要。蒸汽爆破预处理是当前被广泛应用的化学预处理技术之一，是一种基于酸水解的预处理方法，能够较大地提高酶水解效率［1］。蒸汽爆破预处理不仅会改变底物甘蔗渣的结构，还会使底物中的半纤维素和木质素发生水解反应。半纤维素酸水解产物中含有微生物生长抑制因子，阻碍了下游发酵［2］，而且木质素水解产物如酚类物质也会抑制微生物的生长。但是这些在发酵培养基中具有抑制微生物生长的因子却可以在食品工业中被用来作为防止食品酸败和延长存储期的有用物质［3］。因此，提取蒸汽爆破甘蔗渣中的酚类物质以及其他毒性因子不但有利于乙醇发酵菌种的生长，而且可以得到食品工业中有用的添加剂。随着对自然来源的食品添加剂需求的不断增加，人们已经特别注意到以植物废弃物为原料制备食品添加剂［4］。已有大量研究表明酚类物质具有较强的抗氧化活性［3，5］，可以用作食品添加剂。本研究评估了Folin－Ciocalteu法在测定蒸汽爆破甘蔗渣不同溶剂提取液中酚类物质含量的方法适用性以及不同溶剂提取液的DPPH自由基清除能力、还原力。检测了不同溶剂提取液中总糖的含量，为下游发酵工艺路线设计提供了基础数据。

2011－11－07 *通讯联系人

李晶博(1985－)，男，硕士，助理实验师。研究方向:纤维素综合利用。

广州市科技支撑计划项目(2009Z2－D521);中华环保基金会绿动未来项目。