臭氧对苹果汁中棒曲霉素的降解效果研究

李艳玲，惠 伟，*，赵政阳，王 燕

(1.陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062;2.西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100)

臭氧对苹果汁中棒曲霉素的降解效果研究

李艳玲1，惠 伟1，*，赵政阳2，王 燕1

(1.陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062;2.西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌712100)

主要研究臭氧对苹果汁中棒曲霉素(Pat)的降解效果及对果汁品质的影响。研究采用臭氧对水和苹果汁中500、250、200、100、50μg/L Pat浓度进行5、10、15、20、30min的降解处理。结果表明，臭氧处理对各浓度的Pat都有降解作用，浓度越低，降解效果越好。随着处理时间延长降解效果越好，15min以后降解率不再增加。臭氧处理15min，50μg/L的Pat降解效率最佳，在该条件下，臭氧对苹果汁的pH、VC含量、可溶性固形物和色值均没有明显的影响，因此，臭氧处理是高效、安全、低廉的Pat降解方法。

臭氧，棒曲霉素，苹果汁

我国苹果汁的产量和出口量在世界上居首位，棒曲霉素(Patulin，简写为Pat)是出口果汁检验的指标之一。Pat是青霉属、曲霉属、裸囊菌属等多种真菌的次生代谢产物，在果品、蔬菜、果蔬汁、果酒、谷物、糕点以及香肠等食品中都发现了Pat。Pat是一种具有神经毒性的真菌代谢产物，具有致癌、致畸和致突变作用［1－2］。所以，引起了世界各国卫生、毒理医学、食品生产和安全等各方面专家学者的极大关注。世界卫生组织(WHO)制定了食品中Pat的最高限量为50μg/L［3］。由于原料中的Pat不能被通常加工过程的高温所破坏，因而造成苹果汁的普遍污染。因此苹果汁中Pat的降解和去除是果汁加工中急需解决的问题。臭氧(O3)是一种具有特殊气味的不稳定气体，是己知最强的氧化剂之一，具有消毒、除臭、灭菌、防霉、保鲜、降解农药残留等多种作用。近年来臭氧的应用迅猛发展，在水处理、空气净化、食品加工贮藏、卫生保健、养殖业等领域得到广泛应用。O3在水中强烈的氧化作用，能产生单原子氧(O)和羟基(OH)，其中羟基氧化还原电位为2.8V，在瞬间对水中的细菌、微生物、有机物进行降解。当O3浓度达到5mg/L就可以全部杀死贮藏环境和果实表面的所有病原微生物，从而有效防止霉变，延长贮藏时间。因为O3在短时间内降解成了氧，因此没有二次污染［6］。1997年，美国电力研究所(EPRI)提出，与食品直接接触的O3应用是非常安全的(ERAS)［7］。利用O3的强氧化性和杀菌消毒特点，其在果蔬保鲜、果汁加工、农药残留降解上应用的研究也越来越多。前人已经研究过吸附［4］、微波［5］的方法降解Pat。吸附的方法脱附时还会形成2次污染，微波的方法需要增加新的设备，增加加工的工艺过程，因而提高成本，微波也会带来果汁温度的变化。臭氧具有很强的氧化性，有杀菌作用。在苹果汁加工中，原料的消毒、果汁的杀菌过程都用到臭氧，国外研究利用HPLC－DAD色谱法检测，臭氧可以破坏水溶液和苹果汁中的Pat［8］，然而对于将臭氧的强氧化性作用在Pat的降解上，至今国内未见报道。而本研究正是对这一设想的尝试，研究了臭氧对苹果汁中Pat的降解作用以及对果汁品质的影响，为臭氧在果汁加工中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红富士 陕西苹果市场;Pat标准品 sigma公司;Pat溶液 准确称取4mg Pat标准品，溶于1mL双蒸水中，将配制好的溶液用双蒸水分别稀释成500、250、200、100、50μg/L的 Pat溶液;乙酸乙酯、碳酸钠、冰乙酸 分析纯;乙腈 色谱纯;双蒸水。

LC－2010高效液相色谱仪 日本岛津公司;RE－52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司; KQ3200B超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司;JG9060臭氧发生器 陕西金阳电子科技有限公司，输出臭氧量≥480mg/h。

1.2 样品制备

1.2.1 臭氧处理对水中Pat的降解效果 取5个洁净锥形瓶，分别放入20mL各浓度(500、250、200、100、50μg/L)的Pat溶液，打开臭氧发生器，将臭氧分别通入这5个锥形瓶中，通入时间为5min。

1.2.2 臭氧处理对苹果汁中Pat降解效果研究 将优质苹果洗净，榨汁，共320mL，将其平均分成A、B两组。A组中加入2μL已经配制好的4mg/mL的Pat溶液，摇匀。取20mL A组溶液，臭氧发生器处理15min。取5mL处理液，用20mL双蒸水转移至分液漏斗内，加入25mL乙酸乙酯，振摇1min，静置分层，取水层，继续用乙酸乙酯提取2次。合并提取液，1.4%碳酸钠水溶液萃取(10s内完成)，乙酸乙酯提取碳酸钠水层一次，合并提取液。加4滴冰醋酸，在45℃旋转蒸发器上蒸发至近干，晾干。乙酸盐缓冲液复溶后定容到1mL，经0.45μm针头过滤器过滤，供HPLC测定［9］。

B组加入2μL已经配制好的4mg/mL的Pat溶液，摇匀。取5mL试样，用20mL双蒸水转移至分液漏斗内，加入25mL乙酸乙酯，振摇1min，静置分层，取水层，继续用乙酸乙酯提取2次。合并提取液，1.4%碳酸钠水溶液萃取(10s内完成)，乙酸乙酯提取碳酸钠水层一次，合并提取液。加4滴冰醋酸，在45℃旋转蒸发器上蒸发至近干，晾干。乙酸盐缓冲液复溶后定容到1mL，经0.45μm针头过滤器过滤，供HPLC测定［9］。

1.3 测定方法

1.3.1 水中臭氧浓度的测定 在100mL碘量瓶中加入20%碘化钾溶液1.14mL，加入臭氧发生器产生的臭氧水20mL，混匀，加入3moL/L硫酸溶液5mL，用0.099mol/L的硫代硫酸钠标准溶液滴定至近无色时加1%淀粉溶液1mL，继续滴定至溶液无色，计算臭氧的含量。

1.3.2 Pat含量的测定 色谱柱:C18柱，25.0cm× 4.6cm;溶剂:乙腈－水(1∶10)，流速:1mL/min，检测器:紫外检测器UV=276nm;进样量:15μL。通过标准曲线计算Pat含量。Pat降解率(%)=(对照双蒸水中Pat含量－臭氧水作用后Pat含量)/对照双蒸水中Pat含量×100%。

制作标准曲线:取100μL已经配制好的4mg/mL Pat溶液，用乙酸盐缓冲液稀释成100μg/mL的标准储备液，用此储备液再稀释成浓度为10μg/mL的标准工作液。将上述标准工作液用乙酸盐缓冲液分别稀释至浓度为50、100、150、250和500μg/L的标准溶液。将20μL各标准溶液分别注入色谱仪，按色谱条件进行测定，以峰面积对Pat含量(单位为μg/L)作出标准曲线［10］。

1.4 臭氧处理对苹果汁理化性质的影响

可溶性固形物按GB12143.1－89［11］的方法进行测定;色值按QB/T1687－93－5.4［12］的方法进行测定;pH按ISO1842－1975［13］的方法进行测定;维生素C含量用钼蓝比色法测定［14］。

1.5 数据处理

所有处理重复三次，取其平均值作为最后结果，图中数据为平均值±标准误差(¯X±S)，图中相同字母表示数据间差异不显著(P＞0.05)。数据分析采用EXCEL和SPASS16.0专业版统计软件进行处理。

2 结果与讨论

2.1 实验水中臭氧的含量

用碘量法测定水中的臭氧浓度，由表1可以得出，水中臭氧浓度受到通气时间的影响。在水体积相同的条件下，通气时间越长，则臭氧浓度越高。由于臭氧的不稳定，臭氧在水中的浓度不单是量的积累，且伴随着逸出和分解。所以，不能简单的根据臭氧产量和时间推算臭氧浓度，而应该以碘量法测定不同时间点时水中的臭氧浓度。

表1 水体积，通气时间和臭氧浓度之间的关系Table 1 Relationship between the volume of water，ventilation time and the concentration of ozone

2.2 臭氧对Pat的降解效果

2.2.1 臭氧对水中Pat的降解效果 由图1得出，臭氧处理500、250、200、100、50μg/L的Pat溶液15min后，Pat含量均降低，其中500、250μg/L Pat溶液处理后差异不显著;Pat溶液浓度越低，臭氧处理降解效果越好，差异越显著(P＜0.05，n=3);50μg/L的Pat溶液降解到10.5μg/L，降解率为79%，降解效果最好。因此，50μg/L的Pat溶液为臭氧处理的最佳处理浓度。

Cataldo用高剂量的O3发生器(12%，w/w)处理浓度为6.8×10－3mmol/L(相当于1000μg/L)的Pat水溶液，Pat降解率达到92%［8］。

由图2可知，50μg/L的Pat溶液，臭氧处理5、10、15、20和30min后，Pat含量均有显著降低(P＜0.05，n=3);其中臭氧处理时间越长，降解效果越好;但处理15min以后的降解效果并没有显著增加;臭氧处理15min时降解率达到93.63%。因此，臭氧处理15min为最佳处理时间。

图1 臭氧处理15min后对不同浓度Pat的降解率(¯X±S，n=3)Fig.1 The degradation results of ozone on Pat solution after 15min treatment(¯X±S，n=3)

图2 不同臭氧处理时间对50μg/L的Pat降解效果(¯X±S，n=3)Fig.2 The effects of degradation Pat of 50μg/L that ozone treatments for different times(¯X±S，n=3)

2.2.2 臭氧处理对苹果汁中Pat降解效果 根据上面的实验结果，总结得出臭氧处理15min，Pat浓度为50μg/L时效果最明显，因此以下实验都依据这个条件进行臭氧处理。从图3中可知，臭氧对苹果汁中Pat有明显降解效果，且降解率较高，降解了约为43.22%，差异显著(P＜0.05，n=3)，臭氧处理效果明显。Cataldo用高剂量的O3发生器(12%，w/w)处理Pat浓度为2.4×10－3mmol/L(当于370μg/L)的苹果清汁，臭氧处理后Pat基本检测不到［8］。

树脂吸附法是去除Pat最常用的方法，在用树脂处理果汁的初始阶段可以将果汁中的Pat全部除去，但运行12h后，吸附棒对果汁中Pat的吸附效率逐渐下降［5］;微波处理也是降解棒曲霉素一种常用的方法，降解率较高，然而需要增加新的设备和工艺过程，提高了成本;而臭氧对苹果汁中Pat降解效率较高。

2.3 臭氧处理对苹果汁理化性质的影响

由表2可以看出，臭氧处理对苹果汁色值有一定的影响，但并不显著，它使苹果汁的色值升高，主要原因是其存在带有发色团和助色团的有机物。臭氧氧化能破坏发色团和助色团的共轭体系，将其氧化成小分子的有机物或无机物，使其失去发色能力，从而使苹果汁色值升高，颜色变浅［15］。

臭氧处理对苹果汁的可溶性固形物含量几乎无影响。以糖度为例，可能是由于臭氧不能氧化多羟基的醛酮，从而使果汁中的糖类物质不发生变化，导致糖度不变［15］。

图3 臭氧处理15min对苹果汁中50μg/L的Pat的降解效果(¯X±S，n=3)Fig.3 The degradation effects of ozone treatments of 15min on 50μg/L Pat in the apple juice(¯X±S，n=3)

臭氧处理可使苹果汁的pH降低，但差异不显著。这主要是由于臭氧氧化使苹果汁中总酸度提高，从而使游离的氢离子增多，pH减小［15］。

臭氧处理的苹果汁VC含量有所下降。原因是VC有很强的还原性，很容易被强氧化剂臭氧氧化。由于此次臭氧浓度不是很高，因此影响不显著。

Cataldo用高剂量的O3发生器(12%，w/w)对苹果汁的处理过程中，没有破坏可溶性糖的结构，不影响可溶性糖的含量。说明Pat是O3主要攻击目标。不影响果汁品质［8］。复合吸附剂对苹果汁的外观与风味均产生较大的不良影响，进而影响了果汁的品质［16］。

表2 臭氧处理对苹果汁色值、pH、VC含量和可溶性固形物的影响(¯X±S，n=3)Table 2 Effect of ozone on color，pH，VCand soluble solids content of apple juice(¯X±S，n=3)

3 结论

臭氧具有很强的氧化性，有杀菌作用，能有效降解苹果汁中的Pat。臭氧处理15min对50～500μg/L的Pat都有降解效果，15min O3降解水中的50μg/L Pat降解率可以达到93.63%，对苹果汁中的50μg/L Pat的降解可以达到43.22%。在0～15min的时间内随着时间延长，臭氧浓度增加，降解效果也越好。表明O3降解Pat既安全又高效。实验表明O3降解果汁中Pat的同时，对果汁的色值、可溶性固形物、pH、VC含量均没有显著的影响，不会影响果汁的品质。

另外，O3降解果汁中Pat是低投入高产出。臭氧降解可以避免吸附法和微波降解的不足，因为臭氧发生器价格低廉，在果汁加工过程中，臭氧已经应用于原料的清洗消毒以及果汁耐热菌的消毒。因此，用臭氧处理降解Pat，不需要再添置特别的设备，比较经济高效。吸附法也是降解Pat常用的一种方法，然而对于吸附剂的再生处理也是一个很棘手的问题，吸附剂的再生处理会污染环境。臭氧降解法却可以避免这些不足，O3会再次转变成氧，没有任何的二次污染，符合食品安全的要求。

总之，利用臭氧来降解Pat有很多优点，如方便、经济、有效，但是对于臭氧的处理条件，例如处理温度、O3浓度等参数，还需进一步研究探讨，进而找到最佳的工艺条件。

［1］Radhia Mahfoud，Marc Maresca，Nicolas Garmy，et al.The mycotox in patulin alters the barrier function of the intestinal epithelium［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2002，181 (3):209－218.

［2］Hasan HA.Patulin and aflatoxin in brown rot lesion of apple fruits and their regulation［J］.World Journal of Microbiology Biotechnoloy，2000(16):607－612.

［3］Acar J，Gokmen V.The effects of processing technology on the patulin content of juice during commercial apple juice concentrate production［J］.European Food Research and Technology，1998，207(4):328－331.

［4］Leggott NL，Shephard GS，Stockenstrom S.The reduction of patulin in apple juice by three different types of activated carbon［J］.Food Additives Contaminants，2001，18(9):825－829.

［5］张小平，李元瑞，师俊玲，等.苹果汁中Pat控制技术研究进展［J］.中国农业科学，2004，37(11):1672－1676.

［6］Cullen PJ，Tiwari BK，Donnell CP，et al.Modelling approaches to ozone processing of liquid food［J］.Trends in Food Science and Technology，2009，20(3－4):125－136.

［7］Graham DM.Use of ozone for food processing［J］.Food Technology，1997，51(6):72－75.

［8］Cataldo Franco.Ozone decomposition of patulin—A micotoxin and food contaminant［J］.Ozone:Science and Engineering，2008，30:197－201.

［9］乌日娜，李建科，仇农学，等.浓缩苹果汁加工链中Pat的动态分析研究［J］.食品工业科技，2005，26(3):163－164.

［10］张艺兵，李寅宾，张鹏，等.高效液相色谱法测定苹果汁中的Pat［J］.卫生研究，1998，27(S1):146－148.

［11］GB 12143.1－89软饮料中可溶性固形物的测定方法折光计法［S］.

［12］QB/T 1687－93－5.4［S］.

［13］ISO 1842－1975(E)水果和蔬菜产品pH的测定［S］.

［14］高俊凤.植物生理学实验指导［M］.北京:高等教育出版，2006:203－204.

［15］高春燕，田呈瑞，陈颖.臭氧处理对苹果汁某些理化性质的影响［J］.食品工业科技，2004，25(12):72－73.

［16］Huebner HJ，Mayura K，Pallaroni L，et al.Development and characterization of a carbon－based composite material for reducing patulin levels in apple juice［J］.Journal of Food Protection，2000，63(1):106－110.

Effect of ozone treatment on patulin degradation of apple juice

LI Yan－ling1，HUI Wei1，*，ZHAO Zheng－yang2，WANG Yan1
(1.College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China; 2.College of Horticulture，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China)

The effect of ozone treatment on Pat degradation in apple juice and the impact on the juice quality were studied.Especially，the effect of ozone on the Pat degradation in the water and apple juice to different concentrations in 500，250，200，100，50μg/L Pat for different time 5，10，15，20，30min were studied.The results showed that ozone could degrade Pat，the lower the Pat concentration was，the better the effect of degradation was.With the degradation time prolonging，the results were better，after 15min the degradation rate would not increase.By ozone treatment 15min，degradation efficiency of apple juice inclusion 50μg/L Pat was the best，and in the experimental conditions，compared with control group，the pH，VCcontent，soluble solids and color values of apple juice were not significantly changed，so the ozone treatment was an effective，safe，inexpensive way to Pat degradation.

ozone;patulin;apple juice

TS255.44

A

1002－0306(2012)10－0120－04

2011－08－29 *通讯联系人

李艳玲(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:果蔬生理及贮藏保鲜。

2010年陕西省农业科技攻关项目(NC2010K01－11)。