正交实验法优化枣核黄酮的超声提取工艺研究

张吉祥，欧来良

(1.廊坊师范学院化学与材料科学学院，河北廊坊065000; 2.南开大学生物活性材料教育部重点实验室，分子生物研究所，天津300071)

正交实验法优化枣核黄酮的超声提取工艺研究

张吉祥1，欧来良2

(1.廊坊师范学院化学与材料科学学院，河北廊坊065000; 2.南开大学生物活性材料教育部重点实验室，分子生物研究所，天津300071)

采用正交实验法优选枣核中总黄酮的最佳超声提取工艺。以芦丁为对照品，采用分光光度法进行测定，以枣核中黄酮含量作为考查指标，通过单因素实验研究超声波功率、提取时间、提取温度、料液比和提取溶剂乙醇体积分数对提取效果的影响，再利用正交实验法优化最佳提取工艺条件。结果表明，对枣核黄酮提取影响的大小次序为提取温度＞料液比＞提取时间＞乙醇体积分数＞超声波功率，最佳提取工艺为:提取温度55℃，料液比为1∶50，提取时间为40min，乙醇体积分数为50%，超声波功率为400W，在该条件下枣核黄酮粗品的提取率为12.45%，粗品中黄酮含量为6.83mg·g－1，能显著提高枣核黄酮的提取效率。

正交实验法，超声，提取，枣核，总黄酮

红枣，又名中华大枣、小枣，是鼠李科枣属植物枣(Zizyphusjujuba Mill)的果实［1］。红枣果肉营养丰富且含大量生物活性成分如大枣皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(ziziphussaponinⅠ，Ⅱ，Ⅲ)、酸枣仁皂甙B(jujuboside B)、光千金藤碱(stepharine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、环磷腺苷(cAMP)、环磷乌苷(cGMP)等，具有独特的营养和药用价值［2－5］。目前，除对枣肉中有效成分进行研究外，对以往作为废料丢弃的枣核中有效成分的研究也成为人们关注的课题［6－9］。研究表明，红枣核含黄酮类成分具有预防心脑血管疾病、防癌抗癌之功效［8－9］。目前，天然产物中有效成分的传统提取方法有醇渗漉法、浸渍法、索氏抽提法和加热回流法，但存在提取时间长、溶剂用量大、提取率低等问题。近年来，现代提取技术超声提取法在环境、生化、食品及天然产物等领域得到了广泛的应用，具有设备简单、操作时间短、效率高等优点，已广泛用于提取天然产物中挥发油、苷类多糖、生物碱等有效成分［10－14］。经查阅，采用超声法对红枣核中黄酮类成分进行提取的报导甚少［15］。为此，该实验以红枣核为实验材料，采用正交实验法，利用超声提取法对红枣核中的总黄酮的提取进行研究，旨在获得最佳提取工艺，为红枣核的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

芦丁标准品 中国食品药品检定研究院;红枣枣核样品 河北沧州金丝小枣枣核;乙醇、氢氧化钠分析纯，天津市北方天医化学试剂厂;三氯化铝分析纯，天津市虹迪化工有限公司;亚硝酸钠 分析纯，天津市化学试剂一厂。

SK8200HP超声波清洗器 上海科导超声有限公司;UV－2550型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;FA1604N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;RE－52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;ZK－82B型真空干燥箱 上海实验仪器总厂;微孔过滤器 天津津腾实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制［16］精密称取芦丁对照品20.0mg，用50%的乙醇水溶液溶解并定容至50mL容量瓶中。分别取此溶液0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00mL于25mL容量瓶中，加30%的乙醇水溶液至10mL，加入5%的NaNO20.30mL摇匀后静置10min，加入10%AlCl30.30mL，摇匀后静置10min，加入5% NaOH 4.00mL，加水至刻度摇匀，静置15min，配制成系列标准溶液，在507nm处测定吸光度，以吸光度对浓度做标准曲线。芦丁对照品溶液在此浓度范围内与吸光度成良好线性关系，线性回归方程为A= 0.01925+13.82C，线性相关系数为r=0.9999，标准曲线的线性范围为0.0032～0.048mg·mL－1。

1.2.2 提取工艺流程 枣核→洗净烘干→粉碎过200目筛→加入溶剂→超声提取→0.45μm微孔滤膜过滤得澄清透明液体→减压浓缩回收溶剂→真空干燥→得枣核黄酮提取物粗品→计算提取率→计算粗品中黄酮含量。

1.2.3 浸提条件的选择 研究料液比、乙醇溶液体积分数、温度、提取时间和超声波功率对枣核总黄酮提取的影响，首先做单因素实验考察以上条件对提取率的影响，然后采用正交实验法优化最佳工艺条件。用分光光度计测定507nm处吸光度值，根据

1.2.1 计算得到枣核中黄酮含量，作为枣核总黄酮提取指标。

1.2.3.1 料液比的选择 准确称取5份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL锥形瓶中，分别加入体积分数为50%乙醇溶液30、40、50、60、70mL作为溶剂，设定超声波功率350W，提取温度25℃，提取时间30min，进行超声波提取。浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.2.1步骤测定，在507nm处测定吸光度，计算黄酮提取率。

1.2.3.2 乙醇体积分数的选择 准确称取5份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL锥形瓶中，分别加入50.00mL乙醇溶液作为溶剂，控制乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%，设定超声波功率350W，提取温度25℃，提取时间30min，进行超声提取。浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.2.1步骤测定，在507nm处测定吸光度，计算黄酮提取率。

1.2.3.3 提取时间的选择 准确称取5份粉碎的枣核样品各 1.0000g置于 250mL锥形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作为溶剂，设定超声波功率350W，提取温度25℃，分别控制提取时间10、20、30、40、50min进行超声波提取。浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.2.1步骤测定，在507nm处测定吸光度，计算黄酮提取率。

1.2.3.4 超声波功率的选择 准确称取5份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL锥形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作为溶剂，设定超声波功率分别为250、300、350、400、450W，提取温度25℃，超声提取30min，浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.2.1步骤测定，在507nm处测定吸光度，计算黄酮提取率。

1.2.3.5 提取温度的选择 准确称取5份粉碎的枣核样品各 1.0000g置于 250mL锥形瓶中，加入50.00mL 50%的乙醇溶液作为溶剂，设定提取温度分别为25、35、45、55、65℃，超声波辐射温度350W，超声提取30min，浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.2.1步骤测定，在507nm处测定吸光度，计算黄酮提取率。

1.2.3.6 最佳工艺条件的选择 为了获得以乙醇溶液作为溶剂，超声提取枣核总黄酮的最佳工艺条件，通过研究料液比、乙醇体积分数、提取时间、超声波功率和提取温度等单因素，确定4个水平进行L16(45)实验(表1)，以黄酮含量为指标，探究超声提取枣核总黄酮的最佳工艺条件。

表1 L16(45)正交因子水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 枣核黄酮粗品提取产率的计算 将浸提液减压浓缩回收溶剂，将产品真空干燥得枣核黄酮粗品，粗品的提取产率计算公式为:

式中:ω为枣核黄酮粗品提取产率，%;X为枣核黄酮提取物粗品质量，g;m为枣核质量，g。

1.2.5 枣核黄酮粗品中黄酮含量的计算 准确称取一定质量的黄酮粗品，溶解并定容至25mL容量瓶中，取一定体积溶液并按1.2.1测定吸光度，将吸光度换算成浓度，计算枣核粗品中黄酮含量。

式中:w为枣核粗品中黄酮纯度(质量分数)，%;c为溶液中黄酮浓度，mg·mL－1;V为所取溶液体积，mL;M为枣核粗品质量，g。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

2.1.1 料液比的选择 实验结果见图1。由图可知，随着溶剂量的增加，总黄酮提取率呈现先升高后降低的趋势。当料液比低于1∶50时，提取率随着料液比的增大而升高，这是因为提取率的高低与黄酮向溶剂扩散的难易程度有关，料液比小，溶剂量少，导致两相界面间的浓度差小，不利于黄酮的扩散。但当料液比高于1∶50时，提取率反而降低，不利用工业生产。因此，选定1∶30、1∶40、1∶50和1∶60作为正交实验中料液比的四个水平。

图1 料液比对枣核黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of solid－liquid ratio on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.2 乙醇体积分数的选择 实验结果见图2。由图可知，随着乙醇体积分数的增大，枣核中总黄酮的提取率先增大后减小。这是因为乙醇对黄酮的溶解度比水大，乙醇对细胞的破坏作用比水强，在超声波作用下表现得更加明显。乙醇体积分数在40%～60%时，枣核黄酮提取率较高，考虑到乙醇体积分数过高会增加生产成本。因此，选定30%、40%、50%和60%作为正交实验中乙醇体积分数的四个水平。

图2 乙醇体积分数对枣核黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.3 提取时间的选择 实验结果见图3。由图可知，随着超声作用时间的增加，枣核总黄酮的提取率迅速增大，可见提取时间越长，提取越充分。但时间超过30min后，黄酮提取率趋于稳定。因此，选定10、20、30和40min作为正交实验中提取时间的四个水平。

2.1.4 超声波功率的选择 实验结果如图4。由图可知，枣核黄酮的提取率随超声波功率的增加而逐渐提高，这是因为随着超声波功率的增大，超声波的空化作用、粉碎作用使细胞膜的结构受到破坏，提高和改善了组织细胞的通透性;此外，超声波的吸收使超声波的动能转化为热能，使得植物组织内部温度升高，有利于有机成分的溶出。但超声波功率大于400W后，枣核黄酮的提取率随超声波功率的增加有所降低。因此，选定300、350、400和450W作为正交实验中超声波功率的四个水平。

图3 提取时间对枣核黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

图4 超声波功率对枣核黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic－wave power on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.5 提取温度的选择 实验结果见图5。由图5可知，随着提取温度的上升，枣核中黄酮的提取率呈现逐渐增大的趋势，但温度超过55℃，提取率趋于稳定。分析原因是:从较低温度升至60℃，热效率升高，分子运动加快，利于黄酮的破壁溶出;但随着温度的继续升高，使部分蛋白凝固从而不利于黄酮溶出，故提取率趋于稳定。据此，选定25℃、35℃、45℃和55℃作为正交实验中提取温度的四个水平。

图5 提取温度对枣核中黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of temperature on the extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates

2.1.6 正交实验 根据单因素实验结果，选取影响枣核总黄酮提取因素中有意义的水平做正交实验，对结果进行极差分析，以确定最佳提取工艺条件。采用L16(45)正交因子水平表(见表1)，设计L16(45)正交实验，实验结果见表2。

由表2数据极差分析可知，RE＞RA＞RC＞RB＞RD，各因素对枣核中总黄酮的提取率的影响程度依次为:提取温度＞料液比＞提取时间＞乙醇体积分数＞超声功率，温度对枣核黄酮提取的影响最为显著，在实验设计的范围内，优化得到超声提取枣核黄酮的最佳条件为:A3B3C4D3E4，即料液比为1∶50，乙醇体积分数为50%，提取时间为40min，超声波功率为400W，提取温度55℃。

表2 L16(45)正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 最佳工艺条件的验证

按A3B3C4D3E4条件进行三次平行实验，结果见表3所示。

表3 正交实验优化条件下枣核中黄酮含量Table 3 Extraction efficiency of flavone in seeds of Chinese dates under optimal condition with Orthogonal Test

由表3可知，A3B3C4D3E4条件下枣核黄酮提取率高于表2中的实验结果，故A3B3C4D3E4为最优化实验条件。

2.3 枣核黄酮提取物粗品的制备

取3份枣核样品各10.0000g，采用上述最佳提取条件进行提取，得黄酮提取液，再按照1.2.2提取工艺流程，将该溶液进行浓缩精制，得到枣核黄酮粗品，称量计算得平均质量为1.2451g，计算黄酮粗品提取产率为12.45%，该枣核黄酮粗品中黄酮含量为6.83mg·g－1，约为枣核样品中黄酮含量的7.8倍。

3 结论

3.1 本实验采用正交实验法优选枣核黄酮的最佳提取工艺条件，在最佳实验条件:料液比1∶50，乙醇体积分数50%，提取时间40min，超声波功率400W，提取温度 55℃，得到枣核黄酮粗品的提取率为12.45%，粗品中黄酮含量为6.83%。

3.2 实验利用超声提取方法，可以极大地缩短提取时间，且能达到较高的提取效率。因此，超声提取法是一种较为理想的提取方法，具有省时、高效、节能的优点。

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Study on ultrasonic extraction of total flavone from seeds of Chinese dates with orthogonal test

ZHANG Ji－xiang1，OU Lai－liang2
(1.Faculty of Chemistry and Material Science，Langfang Teachers’College，Langfang 065000，China; 2.Key Laboratory of Bioactive Materials，Ministry of Education，Institute of Molecular Biology，Nankai University，Tianjin 300071)

The optimal condition for ultrasonic extraction of flavone from seeds of Chinese dates was investigated by orthogonal test.The total flavone content of seeds of Chinese dates was determined by using spectrophotometry method with rutin as reference substance.In the single factor analysis，the effect of ultrasonic－wave power，extraction time，extraction temperature，solid－liquid ratio and ethanol(extraction solvent)volume fraction were measured.The orthogonal test was used to optimize the conditions of extraction.The results showed that the order of extraction effectiveness was as follows:extraction temperature＞solid－liquid ratio＞extraction time＞ethanol volume fraction＞ultrasonic－wave power.The optimum conditions were extraction temperature 55℃，solid－liquid ratio1∶50，extraction time 40min，ethanol volume fraction 50%，and ultrasonic－wave power 400W.Under the optimized extraction conditions，the yield of flavone crude product was 12.45%，the content of total flavone was 6.83mg·g－1.The results indicated that operating efficiency of extracting total flavone from seeds of Chinese dates was remarkably increased by orthogonal test and ultrasonic wave extraction.

orthogonal test;ultrasonic－wave;extraction;seeds of Chinese dates;total flavone

TS201.2

A

1002－0306(2012)10－0280－04

2011－09－08

张吉祥(1973－)，男，博士，副教授，研究方向:天然产物中有效成分的提取与分离。

河北省教育厅青年基金资助项目(2010156)。