鹿茸醇提物对小鼠学习记忆功能的影响

赵玉红，张 睿，潘 强

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

鹿茸醇提物对小鼠学习记忆功能的影响

赵玉红，张 睿，潘 强

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

目的:研究鹿茸醇提物(AVAE)对小鼠学习记忆能力的影响。方法:156只昆明种雄性小鼠分成空白组(12只小鼠，灌胃生理盐水)、记忆获取阶段组、记忆巩固阶段组和记忆再现阶段组(每组48只小鼠)，各阶段组中的高、中、低剂量组每天每只小鼠分别灌胃鹿茸乙醇提取物的干粉量为1kg/(kg·d)、0.5kg/(kg·d)和0.1kg/(kg·d)。灌胃30d，测定各个记忆阶段小鼠跳台实验的潜伏期及错误次数、水迷宫实验的游出时间及错误次数和小鼠大脑内的SOD酶活力及MDA含量。结果:鹿茸醇提物能明显延长各个阶段小鼠跳台实验的潜伏期(P＜0.01)并减少错误次数(P＜0.01);缩短小鼠水迷宫实验的游出时间及减少错误次数(P＜0.01，P＜0.05);提高小鼠脑内SOD酶活力(P＜0.01，P＜0.05);降低小鼠脑内MDA含量(p＜0.01，p＜0.05)。结论:鹿茸醇提物对小鼠学习记忆障碍有明显的改善作用。

鹿茸醇提物，学习记忆，跳台实验，水迷宫实验

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明种小鼠 由哈尔滨肿瘤医院提供，雄性，体重(20±2)g;鹿茸醇提物 冷冻鲜茸切块、冻干、粉碎，过40目筛，用80%乙醇，料液比1∶50，常温浸提3d，浸提物用旋转蒸发仪除去乙醇，浓缩物根据不同剂量组的用量加水稀释到特定浓度;无水乙醇、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒 南京建成生物工程研究所。0.05)。

TGL－16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂; T6型紫外/可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;ALPHA1－2冷冻干燥机 德国CHRIST公司;LW－Ⅱ水迷宫、跳台仪 中国医学科学院药物研究所。

表1 跳台法测定鹿茸醇提物对小鼠记忆获取、巩固、再现障碍的影响(¯x±s，n=12)Table 1 Effect of AVAE on memory obtain，consolidate and reappearance impairment mice by jumping platform experiment(¯x±s，n=12)

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与给药 156只昆明种雄性小鼠，按体重平均分成13组，即空白组(灌胃生理盐水);记忆获取阶段高、中、低剂量组(用鹿茸乙醇提取物干粉量分别为1、0.5和0.1kg/(kg·d)，灌胃)和模型组(实验前腹腔注射戊巴比妥钠15mg/kg);记忆巩固阶段高、中、低剂量组(用鹿茸乙醇提取物的干粉量分别为1、0.5和0.1kg/(kg·d)灌胃)和模型组(实验前腹腔注射亚硝酸钠120mg/kg);记忆再现阶段高、中、低剂量组(用鹿茸乙醇提取物的干粉量分别为1、0.5和0.1kg/(kg·d)灌胃)和模型组(实验前灌胃30%乙醇10mL/kg)，每组12只，连续灌胃30d。

1.2.2 跳台实验测定小鼠学习记忆能力 实验装置为一长方形反射箱，分为2间，底面辅以间距为0.5cm铜栅。每间左右角置一高和直径均为4.5cm的绝缘台。实验分训练和测验两个部分(记忆获取阶段不需要训练)。训练阶段:第29d给药后用跳台仪训练，训练时先将小鼠放入反射箱内适应3min，然后立即通以40V交流电，令小鼠产生记忆。实验阶段:第30d给药后30min，记忆获取阶段动物除空白组外均腹腔注射戊巴比妥钠15mg/kg形成记忆获取障碍［13］;记忆巩固阶段动物除空白组外均腹腔注射亚硝酸钠120mg/kg［14］形成记忆巩固障碍;记忆再现阶段动物除空白组外均灌胃30%乙醇10mL/kg bw形成记忆再现障碍。实验时将小鼠放入跳台装置适应3min，通以40V交流电，小鼠受到电击后跳回平台以躲避电击为正确反应，如再次跳到铜栅上受到电击，即为错误反应，记录5min内的错误次数和潜伏期，作为小鼠的学习成绩［11］。

1.2.3 水迷宫实验测定小鼠学习记忆能力 实验装置为一长1.1m×0.7m×0.3m的玻璃槽，槽的一端有阶梯，动物可顺其爬上，槽内为迷宫状，多处有盲端，只有一条可达到阶梯，实验时槽内充水，水深9cm，水温(30±2)℃。水迷宫实验分训练和测验两个部分。训练阶段:从给药第25d开始，对各组小鼠进行水迷宫训练，其中记忆获取阶段小鼠除空白组外每天要在灌胃后腹腔注射戊巴比妥钠15mg/kg形成记忆获取障碍后再进行训练，到第29d时，所有小鼠可以自行游出水迷宫。实验阶段:第30d给药后30min，记忆获取阶段动物除空白组外均腹腔注射戊巴比妥钠15mg/kg形成记忆获取障碍;记忆巩固阶段动物除空白组外均腹腔注射亚硝酸钠120mg/kg形成记忆巩固障碍;记忆再现阶段动物除空白组外均灌胃30%乙醇10mL/kg bw形成记忆再现障碍。实验时将小鼠从水迷宫长臂端轻轻放入水中，其在110s内直接到达平台为正确反应，以每组平均错误次数和抵达平台所需时间作为小鼠的学习成绩［13］。

1.2.4 小鼠脑组织中SOD酶活力和MDA含量的测定 取进行过跳台和水迷宫实验的记忆再现组高、中、低剂量组的小鼠和空白组小鼠，脱臼处死，于冰浴上开颅取脑组织，按照试剂盒上的说明，测定各组小鼠SOD酶活力和MDA含量。

1.2.5 统计方法 各项指标均采用Minitab15软件统计，并进行方差分析，实验数据均以x±s表示。

2 结果与讨论

2.1 跳台实验测定小鼠学习记忆能力

戊巴比妥钠有催眠和麻醉的作用，腹腔注射可形成记忆获取障碍;亚硝酸钠可麻痹血管运动中枢、呼吸中枢及周围血管，形成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白不能携氧和可逆性地释放氧，使原来可与氧结合的铁离子部位都失去电子，与羟基或氯化物牢固地结合，导致大脑缺氧，形成记忆巩固障碍;乙醇为中枢抑制剂，灌胃较低浓度即可明显破坏记忆过程，形成记忆再现障碍。采用1.2.2方法可以得到如表1。

表1显示，对于记忆获取实验，模型组与空白组相比，潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，证明记忆获取障碍模型建模成功。各剂量组与模型组相比，潜伏期均有所延长，错误次数均有所降低。经统计分析，各剂量组的两项指标与模型组相比都有极显著差异(P＜0.01)，各剂量组的作用效果由强到弱依次为中剂量组＞低剂量组＞高剂量组。高剂量组作用效果较差可能是由于灌胃的提取物浓度较高，对学习记忆能力有一定的抑制作用。

对于记忆巩固实验，模型组与空白组相比，潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，证明记忆巩固障碍模型建模成功。各剂量组与模型组相比，潜伏期均有所延长，错误次数均有所降低。经统计分析，中、低剂量组的两项指标与模型组相比都有极显著差异(P＜0.01)，高剂量组模型组相比，潜伏期有极显著差异(P＜0.01)，错误次数有显著差异(P＜0.05)，各剂量组的作用效果由强到弱依次为中剂量组＞低剂量组＞高剂量组。

表2 水迷宫法测定鹿茸醇提物对小鼠记忆获取、巩固、再现障碍的影响(¯x±s，n=12)Table 2 Effect of AVAE on memory obtain，consolidate and reappearance impairment mice by water maze experiment(¯x±s，n=12)

对于记忆再现实验，模型组与空白组相比，潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，证明记忆再现障碍模型建模成功。各剂量组与模型组相比，潜伏期均有所延长，错误次数均有所降低，经统计分析，中剂量组的两项指标与模型组相比都有极显著差异(P＜0.01)，低、高剂量组与模型组相比，潜伏期有极显著差异(P＜0.01)，错误次数有显著差异(P＜0.05)，各剂量组的作用效果由强到弱依次为中剂量组＞低剂量组＞高剂量组。

2.2 水迷宫实验测定小鼠学习记忆能力

表2显示，对于记忆获取实验，模型组与空白组相比，小鼠游出水迷宫的时间明显延长，错误次数明显增多，证明记忆获取障碍模型建模成功。各剂量组与模型组相比，游出水迷宫的时间均有所缩短，错误次数均有所降低。经统计分析，中剂量组两项指标与模型组相比有极显著差异(P＜0.01);低剂量组与模型组相比，游出水迷宫时间有显著差异(P＜0.05)，而错误次数有极显著差异(P＜0.01);高剂量组的两项指标与模型组相比均有显著差异(P＜0.05)。由各剂量组与模型组数值差异的大小可得出结论:各剂量组的作用效果由强到弱依次为中剂量组＞低剂量组＞高剂量组。

对于记忆巩固实验，模型组与空白组相比，小鼠游出水迷宫的时间明显延长，错误次数明显增多，证明记忆巩固障碍模型建模成功。各剂量组与模型组相比，游出水迷宫的时间均有所缩短，错误次数均有所降低。经统计分析，中、低剂量组的两项指标与模型组相比有极显著差异(P＜0.01);高剂量组与模型组相比，游出水迷宫时间有显著差异(P＜0.05)，而错误次数有极显著差异(P＜0.01);由各剂量组与模型组数值差异的大小可得出结论:各剂量组的作用效果由强到弱依次为中剂量组＞低剂量组＞高剂量组。

对于记忆再现实验，模型组与空白组相比，小鼠游出水迷宫的时间明显延长，错误次数明显增多，证明记忆再现障碍模型建模成功。各剂量组与模型组相比，游出水迷宫的时间均有所缩短，错误次数均有所降低。经统计分析，中剂量组两项指标与模型组相比有极显著差异(P＜0.01);低剂量组与模型组相比，游出水迷宫时间差异不显著，但错误次数有极显著差异(P＜0.01);高剂量组与模型组相比，游出水迷宫时间差异也不显著，但错误次数有显著差异(P＜0.05)。由各剂量组与模型组数值差异的大小可得出结论:各剂量组的作用效果由强到弱依次为中剂量组＞低剂量组＞高剂量组。

2.3 鹿茸醇提物对小鼠脑中SOD活力和MDA含量的影响

自由基生物学和医学研究表明:自由基可以直接攻击DNA，造成其永久性损伤;可以攻击生物膜的不饱和脂肪酸引起膜脂质过氧化反应;可以攻击蛋白质引起其结构与构象的改变，造成肽链断裂、聚合与交联;所有这些生物大分子结构与功能的改变，必然会导致细胞功能的紊乱，从而导致很多疾病［15］。SOD是一种重要的抗氧化剂，它可以使细胞免受超氧阴离子自由基的攻击，保护脑细胞和脑组织［16］，其活力越高说明学习记忆能力越强。MDA是脂质过氧化作用的终产物，其含量反映脂质过氧化水平，同时间接反映自由基损伤程度，是衡量脑缺血损伤的重要指标［17］。采用1.2.4法可以得到如表3。

表3 鹿茸醇提物对小鼠脑中SOD活力和MDA含量的影响(¯x±s，n=12)Table 3 Effect of AVAE on SOD activity and MDA content of brain in mice(¯x±s，n=12)

表3显示，各剂量组与空白组相比，小鼠脑内SOD活力均有所增强，MDA含量均有所降低。经统计分析，中剂量组与空白组相比，小鼠脑内SOD活力和MDA含量均有极显著差异(P＜0.01);低剂量组与空白组相比，均有显著差异(P＜0.05);高剂量组与空白组相比，差异均不显著。由各剂量组与空白组数值差异的大小可得出结论:各剂量组的作用效果由强到弱依次为中剂量组＞低剂量组＞高剂量组。

3 结论

鹿茸醇提物对小鼠记忆获取、记忆巩固、记忆再现三个阶段的记忆障碍均有明显的改善作用，有助于拮抗超氧阴离子自由基的攻击，保护SOD的活力，抑制脂质过氧化作用，减少MDA的产生，能够有效提高小鼠学习记忆能力。

［1］齐艳萍，李和平，陈雪龙.鹿茸药理作用的研究进展［J］.经济动物学报，2008，12(1):53－55.

［2］UweKierdorf，LiChunyi，JoannaSPrice.Improbable appendages:Deer antler renewal as a unique case of mammalian regeneration［J］.Seminars in Cell Developmental Biology，2009 (20):535－542.

［3］Kierdorf U，Bartos L.Treatment of the growing pedicle with retinoic acid increased the size of first antlers in fallow deer［J］. Comparative Biochemistry and Physiology，1999，124:7－9.

［4］Ha Youngwan，Byong Tae Jeon，Sang Ho Moon，et al. Characterization of heparan sulfate from the unossified antler of Cervus elaphus［J］.Carbohydrate Research，2005，340:411－416.

［5］Zhou Ran，Li Shufen.Supercritical carbon dioxide and cosolvent extractions of estradiol and progesterone from antler velvet［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2009(22): 72－78.

［6］桂丽萍，郭萍，郭远强.鹿茸化学成分和药理活性研究进展［J］.药物评价研究，2010，33(3):237－240.

［7］A Fraser，SR Haines，EC Stuart，etal.Deervelvet supplementation decreases the grade and metastasis of azoxymethane－induced colon cancer in the male rat［J］.Food and Chemical Toxicology，2010，48:1288－1292.

［8］HACK－Seang kim，HWA－Kyung lim，WQQ－Kyu park. Antinarcotic effects of the velvet antler water extract on morphine in mice［J］.Journal of Ethnopharmacology，1999，66:41－49.

［9］HYUNG－Kyoon choi，KYOUNG－Hee kim，KYOUNG Heon kimb，et al.Metabolomic differentiation of deer antlers of various origins by1H NMR spectrometry and principal components analysis［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41:1047－1050.

［10］薄士儒，李庆杰，王春雨，等.鹿茸化学成分与药理作用研究进展［J］.经济动物学报，2010，14(4):243－248.

［11］徐惠波，王本样，张洁，等.鹿茸神经节甙酯对小鼠学习记忆功能的影响［J］.中国药理学通报，1991，7(5):385－388.

［12］王本祥，周秋丽.鹿茸的化学、药理及临床研究进展［J］.药学学报，l991，26(9):714－720.

［13］李植钦.水罗伞对小鼠记忆获得障碍的影响作用研究［J］.广东药学院学报，2002，18(2):124－126.

［14］蒋时红，苗明三.安神益智胶囊对阴虚模型小鼠的益智作用［J］.中国中医药信息杂志，1997，4(7):37－38.

［15］郭维玲.抗氧化剂清除自由基的作用机理及结构－活性关系研究［D］.济南:山东师范大学，2007.

［16］Xu Yanji，HanChunji，XuSongji，etal.Effectsof Acanthopanax senticosus on learning and memory in a mouse model of Alzheimer’s disease and protection against free radical injuryto brain tissue［J］.NEURAL REGENERATION RESEARCH，2008，3(2):192－195.

［17］陈燕清，李丽，杨发明.红景天对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力及海马组织SOD、MDA影响的实验研究［J］.山西中医学院学报，2008，9(2):22－24.

Effect of antler velvet alcohol extracts on improving learning and memory sbilities in mice

ZHAO Yu－hong，ZHANG Rui，PAN Qiang
(School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

Objective:To investigate the effect of antler velvet alcohol extract(AVAE)on learning and memory in mice.Methods:One hundred and fifty－six male Kunming mice were randomized into control group(12 mice，given salty water)，memory obtain stage group，memory consolidate stage group and memory reappearance stage group(48 mice in each group)，each group had 3 small groups:high dose，mid dose and low dose group，given alcohol extract of antler velvet dry matter on 1kg/(kg·d)，0.5kg/(kg·d)and 0.1kg/(kg·d)respectively.After 30d，each stage’s latency and number of errors of jumping platform experiment as well as swimming time and number of errors of water maze were tested，at the same time，the activity of SOD and the content of MDA in mind were evaluated.Results:The AVAE could prolong the latency(P＜0.01)of jumping platform experiment on each stage as well as decreasing the number of errors(P＜0.01)obviously，and decrease the swimming time and the number of errors(P＜0.01，P＜0.05)of water maze，then increase the activity of SOD(P＜0.01，P＜0.05)and decrease the content of MDA in mice brain(P＜0.01，P＜0.05).Conclusions:The AVAE had the function of improving learning and memory impairment obviously.

antler velvet alcohol extract(AVAE);learning and memory;jumping platform experiment;water maze experiment

TS201.4

A

1002－0306(2012)10－0343－04

鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿密生茸毛的未骨化幼角［1］。尽管在多细胞动物中存在器官重生的动物［2］，但鹿茸是哺乳动物界唯一存在的可快速重生的组织器官［3］，在生长季节其生长率约2cm/d［4］。《本草纲目》一书曾将鹿茸列为有极高价值的治疗药剂［5］。鹿茸中含有氨基酸、脂肪酸、脂类、含N类化合物、多糖以及多种对人体有益的微量元素［6］。目前，许多报道证明了鹿茸具有保护心血管、促进创伤愈合［7］、抗损伤、抗炎、抗老化［8－9］、抗应激、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、提高性功能等作用［10］。徐惠波等［11］证明了鹿茸中神经节苷酯可以增强小鼠学习记忆能力，但对于鹿茸醇提物对学习记忆能力的研究还未见报道，文献［12］报道称鹿茸醇提物中的磷脂具有益智的功效，但未有实验数据支持，本研究以乙醇浸泡法制备的鹿茸醇提物为原料，通过动物实验证明鹿茸醇提物的益智作用，为鹿茸的深加工利用提供依据。

2011－07－07

赵玉红(1968－)，女，博士，副教授，研究方向:林特产品精深加工。

黑龙江省教育厅科学技术研究指导项目(11553036);东北林业大学研究生创新项目(gram09)。