Hedgehog通路抑制剂逆转人胰腺癌SW1990细胞获得性耐药的实验研究

姚捷 安勇 钱建军 柏斗胜 徐泽宽 苗毅

·论著·

Hedgehog通路抑制剂逆转人胰腺癌SW1990细胞获得性耐药的实验研究

姚捷 安勇 钱建军 柏斗胜 徐泽宽 苗毅

目的探讨人胰腺癌SW1990耐药细胞株中Hedgehog通路成员(Shh、SMO、Gli1、ABCB1、ABCG2)表达的变化及应用Hedgehog信号通路抑制剂对其耐药性的影响。方法建立人胰腺癌SW1990耐吉西他滨细胞株(SW1990/GZ)。采用Hedgehog信号通路抑制剂环巴明作用耐药细胞，应用实时PCR、蛋白质印迹法检测用药前后细胞Shh、SMO、Gli1、ABCB1、ABCG2 mRNA和蛋白的表达及CD44+CD24+、CD133+细胞亚群比例。以100 μmol/L吉西他滨作用环巴明处理后的SW1990/GZ细胞，应用Annexin V加PI双染法检测细胞凋亡率。结果SW1990/GZ细胞中CD44+CD24+细胞比例从亲代的(29.45±1.99)%增加到(93.16±2.46)%、CD133+细胞比例从(59.37±1.69)%增加到(95.88±1.47)%(P<0.01)；ABCB1、ABCG2、Shh、Gli1 mRNA的表达分别增加(274.90±31.44)、(3.48±0.33)、(12.07±1.71)、(4.15±0.42)倍(P<0.01)，并检测出SMO mRNA表达。蛋白表达结果与mRNA表达一致。2 μmol/L环巴明作用SW1990/GZ细胞1周后，CD44+CD24+比例下降到(36.68±2.44)%、CD133+细胞比例下降到(62.76±1.28)%(P<0.05)。2、5 μmol/L环巴明处理SW1990/GZ细胞后再用100 μmol/L吉西他滨处理细胞，细胞的凋亡加死亡率分别为(53.68±5.24)%和(69.99±3.16)%，显著高于对照组的(4.55±0.87)%(P<0.01)。结论人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高富集肿瘤干细胞，高表达Hedgehog信号通路成员SMO及Gli1。抑制耐药株的Hedgehog通路，可以降低其肿瘤干细胞比例，下调SMO及Gli1表达，部分恢复对吉西他滨的敏感性。

胰腺肿瘤； 肿瘤干细胞； Hedgehog信号通路； 吉西他滨； 获得性耐药

肿瘤细胞固有的和获得性的耐药机制是化疗后复发、转移的主要原因[1-2]。研究表明，人胰腺癌耐吉西他滨细胞株富集肿瘤干细胞[3-4]，而肿瘤干细胞亚群高表达Hedghog(Hh)通路成员Shh[5]。但人胰腺癌耐药细胞株的Hh通路成员表达状况及抑制Hh通路对其的影响尚未知晓。为此，本研究检测胰腺癌耐吉西他滨细胞株(SW1990/GZ)的Hh通路成员及耐药基因ABC家簇成员的表达，观察外源性给予Hh通路抑制剂对其的影响。

材料和方法

一、SW1990/GZ的建立及分组

采用间歇浓度梯度倍增法诱导建立胰腺癌耐吉西他滨细胞株SW1990/GZ，具体操作参考文献[6]。

二、荧光定量PCR

取SW1990/GZ及亲本SW1990对数生长期细胞，应用Trizol提取细胞总RNA。根据Genebank的人ABCB1(MDR1)、ABCG2(BCRP)、Shh、SMO、Gli1和GAPDH的cDNA序列设计引物(5′-3′)。ABCB1上游TGATTGCATTTGGAGGACAA，下游CCAGAAGGCCAGAGCATAAG，产物155 bp；ABCG2上游AGATGGGTTTCCAAGCGTTCAT，下游CCAGTCCCAGTACGACTGTGACG，产物91 bp；Shh上游GTGTACTACGAGTCCAAGGCAC，下游AGGAAGTCGCTGTAGAGCAGC，产物200 bp；SMO上游TTACCTTACGCTGCCACTTCTACG，下游GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC，产物400 bp；Gli1上游CTCCCGAAGGACAGGTATGTAAC，下游CCCTACTCTTTAGGCACTAGAGTTG，产物248 bp；内参GAPDH上游CGACCACTTTGTCAAGCTCA，下游TGTGAGGAGGGGAGATTCAG，产物210 bp。……