LC3在早期糖尿病大鼠肾脏中的表达及意义＊

颜晓勇，张茂平，吴蔚桦

（1.遵义医学院附属医院肾内科，贵州遵义563003；2.泸州医学院附属第二医院肾内科，四川泸州646000）

糖尿病肾病（diabetes nephropathy，DN）为糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，是导致终末期肾功能衰竭和糖尿病致死的主要原因。自噬（autophagy）是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象，自噬性细胞死亡有别于凋亡（Ⅰ型程序性死亡），而被称为Ⅱ型程序性死亡。近年来的研究提示，细胞自噬在肾脏疾病中扮演重要的角色，特别是足细胞病[1－2]，如微小病变肾病、局灶性节段性肾小球硬化（FSGS）、膜性肾病、DN等，推测细胞自噬与DN的发生、发展有关，然而这方面的研究还鲜见报道。本研究检测了DN大鼠模型各时间点细胞自噬标志蛋白——微管相关蛋白1轻链3（microtubule－associated protein 1 light chain 3，LC3）的表达水平和细胞凋亡水平，探讨其关系和意义，为进一步研究DN发病机制和干预治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备 成年雄性SD大鼠48只，8周龄，体质量（230±20）g，购至四川大学实验动物中心。标准化饲养房笼子喂养。设模型组和正常对照组，每组设2、4、6和8周，共4个观察时间点，各组每个时间点6只大鼠。模型组采用1%链脲菌素（STZ，Sigma公司）55 mg／kg一次性腹腔内注射诱导造模。72 h后至少连续3 d尾静脉采血测血糖，以连续3次血糖大于16.7 mmol／L，尿量大于原尿量的150%，尿蛋白排泄大于30 mg／24 h者为成模标准[3]。正常对照组用同剂量的生理盐水腹腔注射。各实验组均采用相同的大鼠标准食物和饮用水，成模后均未使用降糖药。每周测定1次血糖、尿蛋白，并定期监测一般项目。

表1 两组大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比较（n＝6）

1.2 标本收集与生化指标检测 在实验的2、4、6、8周分别通过尾静脉测量大鼠血糖，并将每只大鼠放入代谢笼留取24 h尿液，记录24 h尿量，检测24 h尿白蛋白量（ualb）和24 h尿肌酐浓度（ucrea）；同时从两组中随机选取6只大鼠处死，测量大鼠体质量；股静脉取血5 mL检测血清肌酐（Cr）。经腹主动脉灌注生理盐水后摘取肾脏，立即将右肾组织存入―80℃低温冰箱；称取左肾质量，取左肾组织10%甲醛固定，待作病理学检查。计算内生肌酐清除率（Ccr）和肾脏肥大指数（KI），公式为：Ccr＝[尿肌酐（mmol／L）×尿量（mL）×100]／[血肌酐（mmol／L）×体质量（g）×1 440]，KI＝肾质量／体质量。

1.3 肾脏病理学检测 普通HE染色，观察两组各时点肾小球、肾小管间质病变。

1.4 肾脏LC3免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡、水化，3%H2O2甲醇液浸泡，微波修复抗原，正常羊血清封闭，先后滴加稀释的一抗（兔抗大鼠LC3抗体，英国Abcam公司），羊抗兔二抗，ABC复合物及DAB显色剂，苏木素复染，脱水，透明，甘油明胶封片。以PBS代替一抗作为对照。先低倍镜下观察着染情况，再在高倍镜下随机选皮质区30个肾小球，采用全自动图像分析系统（Image－proplus 6.0）分别计数其积分光密度（IOD）值，取其均值分析。

1.5 原位末端标记法（TUNEL）染色观察凋亡细胞 石蜡切片5μm，二甲苯脱蜡，PBS冲洗，胃蛋白酶消化，PBS冲洗；加TUNEL反应液（武汉博士德公司提供）37℃孵育60 min，PBS冲洗；加碱性磷酸酶抗体37℃孵育30 min，PBS冲洗；加1～2滴BCIP／NBT，室温下孵育10～30 min，PBS冲洗；苏木素复染；水性封片剂封片、烘干，光镜观察细胞核红色为阳性。在光镜下（×400），每组取6个样本，每个样本计数5个不同视野凋亡的肾小管细胞数，与同视野肾小管细胞总数的百分比率，计算其均值，以确定平均凋亡指数[4]。

1.6 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，方差不齐时行数据对数变换使其方差齐，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK－q检验；两组均数比较采用独立样本均数t检验；变量间的关系判断采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组大鼠肾脏病理学比较 肾脏病理HE染色显示正常对照组肾小球、肾小管间质、肾脏血管未发现明显异常，而模型组2周即出现明显肾小球增大，系膜基质逐渐增多，系膜细胞增多，小管扩张。

2.2 两组大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比较 两组大鼠血糖、KI、尿蛋白及Ccr比较见表1。

2.3 两组大鼠LC3免疫组化结果比较 LC3主要表达于肾小管，模型组2、4、6、8周肾脏LC3阳性产物（棕黄色）IOD值均弱于对照组（P＜0.05）；模型组各时点间LC3阳性产物IOD值比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 LC3在大鼠肾组织中的表达情况（免疫组化染色）

2.4 两组大鼠细胞凋亡指数比较 模型组2、4、6、8周肾脏凋亡细胞增多（红色为凋亡细胞），主要出现于肾小管，其凋亡指数均高于对照组（P＜0.05）；模型组各时点凋亡指数比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

A：对照组；B、C、D、E：模型组2、4、6、8周。

2.5 相关性分析 模型组LC3表达量与尿蛋白、KI呈负相关（r＝―0.604，P＜0.01；r＝―0.653，P＜0.01）；模型组肾脏细胞凋亡指数与尿蛋白、KI呈正相关（r＝0.829，P＜0.01；r＝0.801，P＜0.01）；LC3表达量与细胞凋亡指数呈负相关（r＝―0.835，P＜0.01）。

3 讨 论

DN的发病机制至今尚未完全阐明，近年来的研究提示，自噬在肾脏疾病中扮演重要的角色，推测细胞自噬可能与糖尿病肾病的发生、发展有关。本研究显示：LC3主要表达于肾小管，模型组2、4、6、8周肾脏LC3阳性产物（棕黄色）IOD值均弱于对照组（P＜0.05）；模型组各时点间LC3阳性产物IOD值比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组LC3的表达量与尿蛋白、KI呈负相关（P＜0.01）。提示自噬的缺乏可能促进了早期DN的发展。自噬在细胞和组织稳态中发挥重要作用：（1）基础性的自噬有修复细胞和维持细胞生命的作用；（2）过量的自噬会导致细胞程序性死亡[5]。细胞自噬水平的降低使其对肾脏细胞的修复和生命维持功能减弱，引起肾小管功能障碍，对蛋白的重吸收减少和适应细胞代谢负荷增加的功能亦减弱，从而可能导致肾脏损伤。

糖尿病时，内皮细胞葡萄糖转运子表达增加而使胞内葡萄糖含量增加[6]，进而增加了细胞内活性氧，这可能是糖尿病肾病凋亡增加的主要机制[7]。这与本研究结果相一致，模型组2、4、6、8周肾脏凋亡细胞增多（红色为凋亡细胞），主要出现于肾小管，其凋亡指数均高于对照组（P＜0.05）；模型组各时点凋亡指数比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；模型组肾小管细胞凋亡指数与尿蛋白、KI呈正相关（P＜0.01）。表明细胞凋亡与早期糖尿病肾病的发生、发展密切相关。

本研究还发现LC3蛋白表达量与肾小管细胞凋亡指数呈负相关（P＜0.01），且细胞自噬减弱和凋亡增多均主要发生在同一部位——肾小管。细胞自噬可以单独通过细胞保护作用或自身破坏吞噬作用决定细胞的生存和死亡，也能通过比较复杂的机制与细胞凋亡联系起来，从而对细胞产生影响。尽快地清除细胞凋亡残余物是防止组织损伤的关键[8]。有研究表明自噬基因atg5缺失的胚胎同时具有凋亡细胞清除不足和组织损伤[9]。不能有效的清除凋亡细胞会引起组织对自身抗原的耐受，从而导致自身免疫性疾病[8]。细胞自噬对凋亡细胞及其产物的清除不足，可导致组织损伤和炎症，这一机制可能也参与了DN的发生、发展。然而，细胞自噬在DN中的作用及其与细胞凋亡相互作用的具体机制，调高细胞自噬和减少细胞凋亡是否有助DN微血管病变的改善值得进一步研究。

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