单壁纳米碳管联合吡柔比星对膀胱肿瘤抑制效应研究＊

易正金，陈 刚，张 尧，Shiv Kumar Yadav，何云锋△

（1.攀枝花钢铁公司职工总医院泌尿外科，四川攀枝花617023；2.重庆医科大学附属第一医院泌尿外科 400016；3.重庆医科大学 400016）

膀胱癌是中国泌尿外科最常见的恶性肿瘤，膀胱癌的治疗包括可见肿瘤的切除以及后续的膀胱灌注化疗。但在经综合治疗的患者中，45%的患者会再发，再发患者中20%～30%的患者肿瘤会发展成为浸润性膀胱癌[1]。而且，部分患者因不能够耐受化疗药物的不良反应而不能完成膀胱灌注化疗。因此寻找一种安全、有效的，且能有效降低化疗药物不良反应的药物载体成为泌尿外科工作者亟待解决的课题。

1 材料与方法

1.1 材料 修饰的单壁纳米碳管（SWNT）－吡柔比星（THP）复合物的制备：将SWNT和0.2 mmol／L的磷酸支链乙二醇混合，在超声碎化的条件下反应30 min，然后反复过滤、冲洗、制备出活化的SWNT。在超声碎化的条件下根据说明书将琥珀酰酐和THP反应，使琥珀酰酐中的羧酸基团结合在THP上；将修饰的SWNT在8 mmol／L N－羟基丁二酰亚胺和8 mmol／L 1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐条件下在摇床上反应6 h。用p H为7.4的PBS将ACNP－THP混合溶液同比例稀释。多余的没有反应的THP分子通过滤器和反复PBS冲洗清除掉。SWNT的长度在100～150 nm之间。SWNT的载药量为每毫升SWNT含THP 10 mg。

1.2 SWNT－THP对人膀胱癌BIU－87细胞抑制作用研究 BIU－87细胞（购自上海细胞库）在含10%胎牛血清（Hyclone公司）的1640培养基中培养（Hyclone公司）。胰蛋白酶消化后将细胞制悬，接种在6孔板中，分别加入SWNT、THP和SWNT－THP复合物共培养8 h。CSFE增值试剂盒（白云山公司）用于检测细胞活性。CSFE加入细胞悬液在黑暗中反应10 min，然后通过加入等体积的含血清细胞培养液终止染色，同时用无菌水冲洗。荧光强度通过倒置显微镜以及流式细胞仪检测。

1.3 大鼠原位膀胱癌模型的建立 60只8周龄的SD大鼠用N－甲基－N－亚硝基脲（MNU）行膀胱灌注，每次每只大鼠注射0.2 mg，每两周1次，一共4次。第9周末取大鼠膀胱行病理学检查。建模成功的42只大鼠被随机分成4组（SWNT组6只，THP组15只，SWNT－THP复合物组15只，生理盐水组6只），分别用SWNT、THP、SWNT－THP复合物以及生理盐水行膀胱灌注治疗。THP的用量标化到5 mg／kg。

1.4 THP释放检测 灌注治疗后0、1、2、4 h，通过膀胱穿刺取大鼠尿液，用分光光度计研究大鼠尿液THP浓度。标准浓度曲线用万乐公司提供的THP标准品建立。

1.5 体内肿瘤抑制作用检测 灌注化疗后2 d，从每组中随机选取2只大鼠，取大鼠膀胱肿瘤组织。将肿瘤组织通过剪碎、研磨制备成肿瘤细胞悬液。肿瘤细胞通过PI染色行流式细胞检查凋亡率。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，组间比较采用ANOVA或者t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3种材料对BIU－87细胞抑制作用 SWNT对BIU－87细胞无明显抑制效应；THP和SWNT－THP可明显抑制BIU－87细胞增殖，其中SWNT－THP作用更明显。SWNT、THP和SWNT－THP对BIU－87细胞的抑制率分别为（1.74±0.56）%、（51.24±1.45）%和（74.35±2.56）%。

图1 3种材料对BIU－87细胞抑制作用

2.2 各种材料对体内肿瘤的抑制作用 SWNT、THP和SWNT－THP体内肿瘤抑制率率分别为（7.42±1.85）%，（52.46±2.41）%和（96.85±0.85）%。组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 THP缓释效应研究结果 SWNT－THP和THP灌注后，大鼠尿液中THP浓度变化曲线见图2。在灌注1 h后THP灌注大鼠尿液中几乎不能够检测到THP。

图2 THP在尿液中释放曲线图

2.4 不良反应观察结果 在THP灌注的15只大鼠中，12只出现尿频，7只出现血尿。在SWNT－THP灌注大鼠中没有出现尿频或者血尿。两组大鼠在实验前后肝、肾功能检查未发现明显的变化。

3 讨 论

THP是中国泌尿外科常用的一种膀胱内化疗药物，但是由于其溶解度较低，部分患者不能够耐受其不良反应，因此其在临床的应用受到极大的限制。如何提高其治疗作用以及降低其不良反应成为亟待解决的难题。国外一项针对丝裂霉素C的三期临床研究认为提高药物的靶向输送可有效提高其对表浅性膀胱肿瘤的治疗效果[2]。因此，新型的针对膀胱灌注化疗的药物载体的研究为解决该问题提供了一个思路。

SWNT由于其超大的比表面积以及在组织渗透性和组织存留方面的特点成为一种新型的肿瘤靶向的药物载体[3－4]。目前的研究认为纳米活性炭可将大量的生物活性分子，包括药物、多肽、DNA等输送至细胞内[5－8]；其进入细胞的方式包括胞吞以及自由扩散[9]；血液中的单壁纳米碳管可通过胆道系统自粪便中排泄出体外[10]；同时研究还认为长期的纳米暴露对机体不会造成伤害[11]。因此，本研究选择SWNT－THP复合物膀胱灌注，同时观察其对BIU－87细胞的抑制效应及对大鼠原位膀胱癌的治疗效果及不良反应。

本研究结果显示，SWNT－THP复合物能够有效抑制BIU－87细胞增殖；同时在体内能有效地引起膀胱癌组织坏死，而不会引起正常组织的坏死；且无明显不良反应。SWNT－THP复合物能够有效抑制BIU－87细胞增殖的原因在于：SWNT有效地提高了THP的溶解度。在本研究中作者将SWNT与磷酸支链乙二醇反应，运用化学加成的方法将磷酸支链（PEG）结合在单壁纳米碳管上，其次运用琥珀酰酐将一个羧基连接在THP分子上，将活化的THP分子与SWNT－PEG作用。通过一个可断裂的键将吡柔比星以及单壁纳米碳管结合在一起。因此，可有效地增强吡柔比星的水溶性。使药物能够达到对肿瘤细胞发挥杀伤作用的浓度。

除水溶性增强外，SWNT能够特异性杀伤对肿瘤组织，可能与SWNT的缓释性及能够穿过肿瘤组织破坏血管有关。前期研究发现在血液中，以SWNT为载体的药物承载系统能够缓慢的释放药物[12－14]。本研究也发现负载在SWNT上面的THP能够缓慢的释放。甚至在大鼠首次排尿4 h后，还能够检测到THP分子；而单纯用THP灌胃，在大鼠第1次排尿后几乎不能够检测到THP在膀胱内存在。SWNT－THP复合物的缓释性保证了THP与肿瘤细胞的充分接触，因此，可增强THP的肿瘤组织杀作用。SWNT可以使得淋巴细胞在肿瘤组织聚集，且能够增强淋巴细胞功能，而SWNT可被内皮细胞吞噬系统吸收。因此，肿瘤组织对SWNT的吸收增强，同时由于肿瘤组织内存在大量的生物活性物质，使非共价结合的SWNT－THP复合物在与肿瘤接触后能够迅速水解，从而特异性杀伤肿瘤组织。

THP用于膀胱灌注主要的不良反应有尿痛，尿频，尿急，血尿和肾脏毒性等[15]。在本研究中，SWNT－THP复合物灌注大鼠没有出现尿痛、尿频、尿急、血尿和肝、肾脏毒性等不良反应。

总之，SWNT显示了较好的膀胱内灌注化疗的应用前景，拥有PEG尾的单壁纳米碳管能够有效改善化疗药物的水溶性；其次，SWNT能够增强肿瘤组织对于化疗药物的吸收，这种吸收具有一定的特异性；再次，SWNT对于组织基本没有毒性。本研究报道了SWNT再膀胱内灌注化疗中的应用，这将为膀胱癌的治疗提供一种新的生物材料选择，促进膀胱肿瘤的治疗研究。

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