NK细胞上清液提高CTL细胞对肿瘤细胞杀伤力及机制的研究

余少鸿，汤荣春，Per H Basse

（1.云南省昆明市第一人民医院普外科 650011；2.美国匹兹堡大学肿瘤中心，匹兹堡PA 15213－1863）

细胞免疫在肿瘤免疫中发挥着重要的作用，其中自然杀伤细胞（NK细胞）及细胞毒性T细胞（CTL细胞）是体内主要的免疫细胞[1]。有研究表明，组织相容性抗原Ⅰ类（MHCⅠ）限制性导致CTL细胞不能有效杀灭肿瘤细胞。下调肿瘤细胞表面人类白细胞抗原（HLA）是肿瘤细胞逃逸CTL细胞重要原因之一[2]。MHCⅠ类抗原部分或全部缺失是黑色素瘤对CTL细胞不敏感因素之一[3－4]。NK细胞可直接杀伤血液循环的肿瘤细胞及肿瘤组织[5]，并且对黑色素瘤肺转移细胞也有杀灭作用[6－8]。细胞因子白细胞介素2（IL－2）、IL－12和IL－18可增强其杀伤及分泌功能[9]。因此，现将本研究NK细胞上清液提高CTL细胞对肿瘤细胞杀伤力及机制报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与肿瘤细胞 选择匹兹堡大学肿瘤中心Jackson实验室无菌环境饲养的C57BL／6雌性裸鼠，8～12周龄，体质量20～30 g；M05黑色素瘤细胞由Per H Basse实验室保存培养，于RPMI1640液中常规培养。

1.2 NK及CTL细胞表型检测 从C57BL／6裸鼠提取出脾脏，磨碎，使之成单细胞悬液；1 200 r／min，离心5 min；溶解红细胞3 min，再离心，过滤，制成脾细胞悬液。计数，T75培养瓶中加入25 mL培养液及6 000 IU／mL IL－2培养。2 d后，用抗CD3抗体磁珠（Dynal Biotech，Lake Success，NY，USA）法纯化，敲除T细胞，制成NK细胞，再加入6 000 IU／mL IL－2培养2～3 d后，制得活化的NK细胞。收获细胞，把每管0.5×107／mL细胞离心，取沉淀，混匀，添加抗体NK 1.1＋、NKp 46、CD3＋、CD4＋和CD8＋各2μL，流式细胞仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）检测表型。NK细胞表型：NKp46＞90%，NK1.1＋＞90%，CD8＋＜2%，CD4＋＜2%。同上提取脾细胞，加入8μg／mL PHA和600 IU／mL IL－2培养。2 d后，可见大量细胞聚集成团，静置5～7 min，轻轻抛弃上清液，即可获得细胞团块，再加入600 IU／mL IL－2培养2 d后，即可制得CTL细胞。CTL细胞表型：CD8＋＞90%，CD3＋＞90%，NK1.1＋＜5%，CD4＋＜2%。NK细胞在IL－2，IL－2＋IL－12，IL－2＋IL－18或IL－2＋IL－12＋IL－18条件下培养，提取上清液。同上法准备NK细胞，用抗CD3磁珠法纯化，再加入6 000 IU／mL IL－2培养1 d后，加入IL－12（10 ng／mL）和IL－18（100 ng／mL）或同时加入IL－12（10 ng／mL）及IL－18（100 ng／mL），再培养48 h后，2 000 r／min离心10 min，收集上清液，－80℃冻存备用。

1.3 ELISA法检测上清液的IFNγ含量 将各种细胞因子活化的NK细胞上清液分为4组，分别为NK上清液，NK＋IL－12上清液，NK＋IL－18上清液，NK＋IL－12＋IL－18上清液，按照说明书应用双抗体夹心ELISA法检测IFNγ，重复3次。

1.4 检测M05细胞表面MHCⅠ（H－2Kb）表达 收集M05细胞，调整细胞密度为1×107／mL，与NK细胞在IL－2，IL－2＋IL－12，IL－2＋IL－18，IL－2＋IL－12＋IL－18条件下提取的上清液125μL孵育过夜。1 d后，收获所有肿瘤细胞，加入H－2Kb抗体染色30 min，PBS缓冲液洗涤2次后，0.25%多聚甲醛固定，FACS计数5 000细胞，检查MHCⅠ表达。

1.5 检测NK细胞对CTL细胞的杀伤率 将51Cr溶液与靶细胞[与不同NK上清液及干扰素γ（IFNγ）]10 ng／mL培养过夜M05细胞，高表达MHCⅠ类分子；或预先用6μg／mL IFNγ抗体与1∶8 NK细胞上清液及IFNγ10 ng／mL各1 mL孵育30 min后，再与NK上清液培养过夜的M05细胞）混合，实验共分为6组，分别为M05组（阴性对照组），M05＋IFNγ组（阳性对照组），M05＋NK上清液组，M05＋NK＋IL－12上清液组，M05＋NK＋IL－18上清液组，M05＋NK＋IL－12＋IL－18上清液组，于37℃培养1 h左右，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞。收集CTL细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合4 h（比例约为200∶1），用γ射线测量仪检测上清液中的51Cr放射脉冲数（cpm）值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。

特异性肿瘤细胞杀伤率（%）＝（特异性释放－自发性释放）／（最大量释放－自发性释放）×100%

1.6 统计学处理 应用SPSS 10.0软件进行统计学处理，计量资料以±s表示，IFNγ抗体封闭后采用配对设计t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NK细胞上清液对M05细胞表面MHCⅠ表达的结果 IL－2能够激活NK细胞增殖，结合其他细胞因子如IL－12及IL－18，能大量刺激NK细胞增殖，释放大量细胞因子，从IL－2、IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18条件下活化的NK细胞提取的上清液，即使稀释浓度为1∶8，也能有效提高M05细胞表面MHCⅠ表达。加入6μg／mL IFNγ抗体与NK上清液125μL孵育30 min，再与肿瘤细胞孵育过夜后，升高的MHCⅠ降至正常。见表1。

表1 M05细胞与1∶8 NK上清液＋／－IFNγ抗体MHC平均荧光强度的表达

2.2 IL－2、IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18活化NK细胞分泌的IFNγ含量 NK＋IL－12上清液、NK＋IL－18上清液、NK＋IL－12＋IL－18上清液的IFNγ高于NK上清液的IFNγ含量（P＜0.05）。见表2。

表2 NK上清液、NK＋IL－12上清液、NK＋IL－18上清液、NK＋IL－12＋IL－18上清液的IFNγ含量

2.3 CTL细胞对黑色素瘤靶细胞的杀伤活性 M05黑色素瘤细胞高表达OVA抗原及低表达MHCⅠ类分子，与NK上清液孵育过夜后能提高M05细胞表面MHCⅠ类分子的表达，CTL细胞对靶细胞的杀伤活性明显增强（P＜0.05），见图1。

2.4 CTL细胞对肿瘤细胞4 h的杀伤率 1∶8 NK细胞上清液与CTL细胞孵育过夜后，可见与NK细胞上清液孵育的CTL细胞并不能提高CTL细胞对M05细胞杀伤率，见图2。

图1 CTL对靶细胞4 h细胞毒性（n＝3）

图2 CTL细胞对肿瘤细胞4 h的杀伤率（n＝3）

3 讨 论

本研究证实，体内外活化NK细胞需要IL－2维持，其他细胞因子，如IL－12及IL－18能增强其作用，IL－2是激发细胞因子如TNFα及IFNγ级联反应的关键因素。作者资料显示IL－2、IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18条 件下培养NK细胞在形态及功能上具有明显差异，并且IL－2＋IL－12、IL－2＋IL－18、IL－2＋IL－12＋IL－18培养NK细胞分泌的IFNγ比仅用IL－2培养NK细胞更高，并 且，IL－12，IL－18需 要 与IL－2共同刺激才能使NK细胞活化并分泌大量IFNγ[12]。研究证实，不同细胞因子刺激的NK细胞上清液均能提高M05细胞MHCⅠ类分子的表达，并且只需要1∶8上清液即可显著提高M05细胞MHCⅠ表达，其作用机理与NK细胞上清液中的IFNγ含量有关，抑制IFN的表达即可降低肿瘤细胞表面MHCⅠ分子。

CTL细胞在体内能直接破坏黑色素瘤细胞，因此，CTL细胞已经成为肿瘤免疫的热点之一[13]。本研究结果显示，正常M05细胞低表达MHCⅠ类分子而高表达OVA抗原，因此，CTL细胞对其杀伤率低，但M05细胞与NK上清液培养后，提高黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达，从而提高CTL细胞对黑色素瘤细胞的杀伤性，这种杀伤作用通过提高黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达而发挥间接作用，为进一步研究联合应用NK及CTL细胞协调杀伤肿瘤细胞提供良好的理论基础。

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