摩尔比对L-赖氨酸/L-甲硫氨酸与L-抗坏血酸Maillard反应产物抗氧化活性的影响

邓启辉，钟存贵，余爱农

（湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北恩施445000）

摩尔比对L-赖氨酸/L-甲硫氨酸与L-抗坏血酸Maillard反应产物抗氧化活性的影响

邓启辉，钟存贵，余爱农*

（湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北恩施445000）

在L-赖氨酸/L-甲硫氨酸与L-抗坏血酸（Lys/Met-ASA）的模式体系中，研究了反应物摩尔比对Maillard反应产物（MRPs）的抗氧化活性的影响。控制反应物不同摩尔比（Lys/Met与ASA的物质的量之比分别为0∶0.002、1∶5、1∶3、1∶1和3∶1），在140℃下加热搅拌制得MRPs，以还原力和1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼自由基（DPPH·）的清除能力为指标，对其产物抗氧化活性进行分析评价。结果表明：在Lys/Met-ASA体系中摩尔比分别为1∶3和1∶5时，产物的还原力、DPPH自由基的清除能力最大；摩尔比对MRPs的抗氧化活性有着显著的影响。

L-抗坏血酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，Maillard反应，抗氧化活性

Maillard反应产物（MRPs）是食品加工和储藏过程中自身产生的一类物质，可以认为是天然存在的。研究发现，食品工业上广泛应用的一些抗氧化剂（如二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和生育酚等）可能具有毒副作用[1]，因此MRPs抗氧化活性的研究成为了当今食品工业研究中的热门课题。L-抗坏血酸（ASA）广泛存在于植物性食品，如水果蔬菜以及动物食品（如牛乳和肝）中，可热降解形成糠醛等醛基化合物[2]，所以在食品化学中也将ASA与氨基酸等的反应归属于Maillard反应。Maillard反应机理十分复杂，反应历程、产物组成及其性质受多种因素影响。研究发现，摩尔比对Maillard反应有着很大的影响，Matmaroh等人[3]在果糖-甘氨酸体系中研究了反应物摩尔浓度对抗氧化活性的影响；Sumaya-Martinez等人[4]在糖-金枪鱼胃的水解物体系中研究了糖的浓度对褐变强度和1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼自由基（DPPH·）清除能力的影响；王惠英等人[5]在赖氨酸（Lys）-核糖体系中对Lys的氨基与核糖的羰基的物质量之比分别为1∶1、1∶2和2∶1的三个体系的MRPs的抗氧化活性进行了研究；尹姿等人[6]在木糖-甘氨酸体系中研究了摩尔比对MRPs抗氧化活性的影响；Rogacheva等人[7]在ASA-甘氨酸体系中研究了不同摩尔比对形成类黑精结构的影响，但没对其抗氧化活性的影响进行研究。通过对Lys/L-甲硫氨酸（Met）-ASA体系受时间和pH因素影响的研究发现，Lys/Met-ASA体系的最佳反应pH为5，最佳反应时间分别为120min和200min，所以本文拟在Lys/Met-ASA体系优化的条件下对其MPRs的抗氧化活性受摩尔比的影响进行研究，为找到新型的抗氧化剂以及ASA的MRPs的抗氧化活性在今后的食品加工与储存过程中得到充分利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Lys、Met 上海源聚生物科技有限公司；菲洛嗪、DPPH Sigma公司；ASA、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化亚铁、三氯化铁、甲醇等试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

PHSJ－3F型pH计 上海精密科学仪器有限公司；UV－2501紫外分光光度计 日本岛津公司；P170005厚壁耐压反应瓶 北京欣维玻璃仪器有限公司；MWCO500型透析袋 武汉鑫思锐科技有限公司。

1.2 实验方法

根据文献[8]略加改动，将ASA溶解于10.0mL 0.2mol/L Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液中，再用NaOH调pH至5，装入48mL P170005厚壁耐压反应瓶中，同时按比例（Lys/Met与ASA的物质的量之比分别为0∶0.002、1∶5、1∶3、1∶1和3∶1，并保持反应物总浓度为0.2mol/L）加入Lys/Met，密封，在140℃下搅拌反应120min/200min，快速冷却至室温后，用MWCO500透析袋进行透析至ρASA≤1.0μg/mL，定容至50mL，放至4℃冰箱中保存备用。以上样品均制备平行样，所有测定值均设二次重复，取平均值。

1.3 测定紫外吸光度和棕色指数

根据文献[9]中的方法，取反应液1.0mL，加入3.0mL二次蒸馏水，分别在294nm和420nm下，用1cm光程长的吸收池测定其吸光度。

1.4 还原力的测定

根据文献[9]的方法并略加改动，取反应液0.5mL，加入1.0mL 0.2mol/L磷酸钠缓冲液（pH6.6）和1.0mL 1%的铁氰化钾，混匀，在50℃的水浴中加热10min，然后加入1.0mL 10%的三氯乙酸。在室温下离心分离10min，取上清液0.5mL加入2.0mL去离子水和0.2mL 0.1%FeCl3，静置15min。用蒸馏水代替1%的铁氰化钾作为空白，在700nm处测定吸光度。用700nm处测定的吸光度减去空白来表示还原力的大小。

1.5 DPPH自由基清除能力的测定

根据文献[9]的方法并略加改动，取反应液0.1mL，加入0.9mL二次蒸馏水和3.0mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液，剧烈混合均匀，在室温下（记录室温）避光静置30min。在517nm处测定吸光度Asample(517nm)，并以1.0mL二次蒸馏水代替样品加3.0mL DPPH甲醇溶液作为对照物吸光度Acontrol(517nm)。测定温度控制在30℃以下。样品清除DPPH·的能力用DPPH·的百分清除率表示。

清除率（%）=（1－Asample(517nm)/Acontrol(517nm)）×100%

2 结果与讨论

2.1 摩尔比对紫外吸光度（A294）的影响

紫外吸光度（A294）表示Maillard反应的高级阶段通过Strecker裂解等过程产生的酮、醛类等无色小分子中间体的吸光强度[3]。摩尔比对紫外吸光度（A294）的影响见图1（相对标准偏差P≤0.05），从图1可以看出，Lys/Met－ASA的MRPs的紫外吸光度在摩尔比分别为1∶3和1∶5时达到最大，随着L－抗坏血酸摩尔比的减小，紫外吸光度也减小。结果表明：摩尔比对Lys/ Met－ASA的Maillard反应所生成的无色小分子中间体有着显著影响，体系摩尔比分别为1∶3和1∶5时所生成的无色小分子中间体最多，而这些大量的无色小分子中间体大部分都来自于Lys/Met－ASA所发生的Maillard反应。这可能是由于ASA在不同浓度下降解产物中羰基化合物种类和数量不同所致[7]。

图1 摩尔比对Maillard反应产物紫外吸光度的影响Fig.1 Effect of molar ratio on UV absorbance of MRPs

2.2 摩尔比对褐变强度（A420）的影响

Maillard反应产物在420nm处的吸光度通常用来表征Maillard反应的褐变强度[9]。图2描述了Maillard反应褐变强度随摩尔比的变化情况（P≤0.05）。从图2可以看出，Lys/Met－ASA的MPRs的褐变强度在摩尔比分别为1∶3和1∶5时达到最大，之后随着ASA的物质量的减小，褐变强度也减小，这可能是因为：a.ASA在不同浓度下降解产物中羰基化合物种类和数量不同所致[7]；同时文献[10]报道了在半乳糖－甘氨酸和葡萄糖－甘氨酸体系中的褐变率也取决于还原糖的浓度；b.过量的氨基酸因受热引起分子内脱水生成内酰胺，从而使得系统中氨基酸的物质量降低，减缓了褐变速率[5]。文献[3，11]报道了褐变是由于糖焦化和Maillard反应所引起的。

图2 摩尔比对Maillard反应产物褐变强度的影响Fig.2 Effect of molar ratio on browning strength of MRPs

2.3 摩尔比对Maillard反应产物还原力（A700）的影响

Maillard反应产物的抗氧化活性与还原力密切相关，产物提供的电子与自由基反应，使自由基成为相对稳定的物质，从而阻断自由基的连锁反应[12]，测定的吸光度值越大说明其还原力越强。图3描述了Lys/Met-ASA的MPRs的还原力随摩尔比变化的情况（P≤0.05），从图3可以看出，Lys/Met-ASA的MPRs的还原力在摩尔比分别为1∶3和1∶5时达到最大，之后随着ASA的物质量的减小，还原力也减小。Yoshimura等人[13]报道了Maillard反应产物中的羟基对还原力有着重要的作用；Hodge等人[14]报道了MPRs中的一些中间产物（如氨基还原酮）具有很强的还原力；Yuan等人[2]报道了ASA在酸性条件下的降解产物主要为糠醛、2-糠酸、3-羟基-2-吡喃酮和一种未知化合物；Feather[15]报道了ASA在pH7.0、37℃有氧时的降解生成的产物为甘油醛、苏糖、木酮（醛）糖、3-脱氧木酮（醛）糖，这些羰基化合物可能与氨基酸中的氨基反应生成氨基还原酮类物质。综上所述，Lys/Met-ASA体系的反应中可能生成的氨基还原酮类物质是还原力的主要贡献者。

图3 摩尔比对Maillard反应产物还原力的影响Fig.3 Effect of molar ratio on reduced power of MRPs

2.4 摩尔比对DPPH自由基清除能力的影响

摩尔比对DPPH自由基清除能力的影响见图4（P≤0.05），由图4可以看出，Lys/Met-ASA体系中摩尔比分别为1∶3和1∶5时MPRs的DPPH自由基清除能力达到最大，随着ASA的物质的量减小，其清除率逐渐下降。这可能是因为Maillard反应在酸性条件下生成的一些小分子（如噻吩、噻唑、噁唑、呋喃等）具有抗氧化活性[16]；另一方面可能是Lys/Met-ASA体系中所生成的大分子物质（类黑精）也具有抗氧化活性。Sumaya-Martinez等人[4]报道了DPPH自由基清除能力与糖的化学结构和浓度有关，Davies等人[17]报道了Maillard反应的反应速率取决于糖的环状结构转变成具有还原性的开链结构的比例。由此推测，在Lys/ Met-ASA体系中，与糖类物质具有类似结构的ASA所占比例可能是影响MPRs的DPPH自由基清除能力的主要因素。

图4 摩尔比对Maillard反应产物的DPPH自由基清除能力的影响Fig.4 Effect of molar ratio on DPPH radical scavenging activity of MRPs

3 结论

通过对Lys/Met-ASA体系的MPRs的抗氧化活性的研究发现，摩尔比对Lys/Met-ASA体系的MPRs的抗氧化活性有着显著的影响，Lys/Met-ASA体系的MPRs的紫外吸光度（A294）和褐变强度（A420）、还原力（A700）、DPPH自由基清除能力在摩尔比分别为1∶3和1∶5时均达到最大。在Lys/Met-ASA体系的反应中可能生成的氨基还原酮类物质是还原力的主要贡献者；与糖类物质具有类似结构的ASA所占比例可能是影响MPRs的DPPH自由基清除能力的主要因素。但是Lys/Met-ASA体系的Maillard反应是个复杂的反应，其反应机理有待于进一步深入研究。

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Antioxidative activity of Maillard reaction products from L-lysine/ L-methionine and L-ascorbic acid model systems as influenced by molar ratio

DENG Qi-hui，ZHONG Cun-gui，YU Ai-nong*
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China）

The objective of this investigation was to study the effect of molar ratio on antioxidative activity of Maillard reaction products（MRPs）from the L-lysine（Lys）/L-methionine（Met）-L-ascorbic acid（ASA）model systems.MRPs were prepared by heating the solution containing ASA and Lys/Met adjusted to pH5 at 140℃for different molar ratios（the molar ratios of Lys/Met to ASA 0∶0.002，1∶5，1∶3，1∶1 and 3∶1）.The antioxidative activity of MRPs was evaluated by reducing power，1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH·）radical-scavenging activity.The results indicated that reduced power and DPPH·radical-scavenging activity of MRPs derived from Lys/Met-ASA model systems reached a maximum with the molar ratios of 1∶3 and 1∶5，respectively.The molar ratios had marked the influence on the antioxidative activity of MRPs.

L-ascorbic acid；L-lysine；L-methionine；Maillard reaction；antioxidative activity

TS201.2

A

1002-0306（2012）01-0049-04

2010－10－08 *通讯联系人

邓启辉（1975-），男，硕士，研究方向：食品化学。

国家自然科学基金资助项目（20876036）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目（T200707）。