豆浆中脲酶活性测定方法的建立及酶学性质的研究

曹 慧，徐 斐

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093）

豆浆中脲酶活性测定方法的建立及酶学性质的研究

曹 慧，徐 斐

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海200093）

生豆浆中的胰蛋白酶抑制因子在实验室中较难检测，但其活性与脲酶活性呈正相关。对此建立了豆浆中脲酶的定量检测方法，并对其酶学性质进行研究。结果表明，采用纳氏试剂测定豆浆脲酶活性的最适条件为：波长415nm，显色剂用量1mL，尿素浓度3%，反应温度35℃，反应时间7min。豆浆中脲酶的最佳作用pH为7.0，最适反应温度为35℃，脲酶在25～40℃之间贮存3h有较好的热稳定性，酶活保留率在80%以上。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法求得脲酶的Vmax为0.173mmol/min，Km为0.0172mol/L。

豆浆，脲酶活性，纳氏试剂法，酶学性质

豆浆因其富含植物性蛋白质、矿物质、维生素等营养元素，素有“植物肉”、“绿色牛乳”之美誉。但生豆浆中含有多种阻碍营养物质利用的抗营养因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃肠胀气因子等[1]。尤其是胰蛋白酶抑制因子能抑制胃蛋白酶、胰蛋白酶等几十种蛋白酶的活性，导致蛋白消化和利用率降低，引起胰腺增生、肿大。胰蛋白酶抑制因子在实验室中较难检测，但其变性失活程度与脲酶相似，因此我们常以脲酶活性作为判断豆浆生熟度的标准[2]。脲酶（urease），又称尿素酶或酰胺水解酶，能特异性地催化尿素水解，产生二氧化碳和氨，其催化反应速度是常规化学催化的104倍，常被用于尿素或重金属的快速检测[3-4]。目前脲酶的测定方法主要有氨气敏电极法定量法、pH增值法、国标纳氏试剂法等。利用氨气敏电极测定单位时间内由脲酶作用所产生的氨数量可定量表示大豆脲酶活性的高低，此法操作较简单，但测定过程中氨容易逃逸，导致实验结果存在较大误差[5]。尿素被样品中的脲酶催化分解产生氨，导致溶液pH增加，增加的程度与脲酶活性大小呈正相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低。pH增值法操作简单、试剂少，但是计算结果不易比较，不够直观[6]。国标法是利用脲酶水解产生的氨，在适当条件下能与纳氏试剂中的碘化钾汞复盐作用生成棕色的碘化双汞铵。国标法灵敏度较高，但只能定性检测，且过程复杂，耗时也较长[7]。因此，本实验拟建立一种脲酶的定量检测方法，并对大豆脲酶的酶学性质进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碘化汞、碘化钾、（NH4）2SO4、尿素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、三氯乙酸等试剂 购自国药集团，均为分析纯。

722S型分光光度计 上海分析仪器厂；SZ－93自动双重纯水蒸馏器 北京东南仪诚实验室设备有限公司；HY－6多用振荡器 金坛市医疗器械厂；J2－HS型台式高速离心机 美国贝克曼公司；SHZ－88台式水浴恒温振荡器 上海医疗器械七厂；九阳料理机 杭州九阳小家电有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 纳氏试剂的配制 称取5.5g碘化汞、4.125g碘化钾溶于25mL水中，溶解后转移到100mL容量瓶中。再称取14.4g氢氧化钠溶于50mL水中，待溶解冷却后，慢慢转移到上述100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后倒入试剂瓶中，静止后取上层清液。

1.2.1.2 硫酸铵标准应用液的配制 精确称取硫酸铵0.9910g（60℃干燥至恒重）加蒸馏水溶解后定容至1000mL容量瓶中，此溶液为1mL≈15μmol的NH4+的贮存液。精确吸取10mL贮存液，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液为1mL≈1.5μmol的NH4+。

1.2.2 标准曲线的建立 准确吸取硫酸铵标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（对应NH4+浓度为0.0、0.75、1.5、2.25、3.0、3.75、4.5μmol）分别置于7支25mL具塞比色管中，加水至9mL，各加纳氏试剂1mL。于415nm波长处测定其吸光值。根据测得的吸光值绘制标准曲线。

1.2.3 豆浆脲酶活性检测方法的确定 取30g大豆，置于250mL蒸馏水中浸泡4h，用料理机打碎，取1mL定容至50mL容量瓶中。取1mL豆浆稀释液，加入1mL尿素溶液（浓度分别为0.5%、1%、3%、5%、7%），恒温水浴反应（反应时间分别为3、5、7、9、11、13min；反应温度分别为25、30、35、40、45℃），反应完毕后加入1mL 10%三氯乙酸溶液，振荡均匀。3000r/min离心5min，取上清液0.5mL置于纳氏试管中，各加8.5mL蒸馏水及1mL纳氏试剂，于415nm处测定吸光值。豆浆中脲酶酶活定义为：在35℃时，每分钟催化产生1μmol氨的酶量为1个酶活力单位，计算公式为：

式中：a：经标准曲线所查得的样品管中的NH4+的微摩尔数。

1.2.4 脲酶酶学性质的研究 将生大豆粉碎，经过35%乙醇浸提、多步分离纯化、最后利用真空冷冻干燥制得大豆脲酶，并对其酶学性质进行研究。

1.2.4.1 温度稳定性 分别在25、30、35、40、45、50、55℃下将脲酶酶液保温3h，检测其在不同温度下保温后的酶的活力变化情况。

1.2.4.2 脲酶的最适反应pH 分别在pH5、6、7、8和9下测定脲酶的活力。

1.2.4.3 米氏常数Km及最大反应速度Vmax的测定 在不同浓度尿素下测定反应的初速度，然后按Lineweaver－Burk双倒数作图法求得酶反应的米氏常数，再由纵轴截距求出酶反应的最大反应速度Vm。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

2.1.1 检测波长的选择 吸取1mL硫酸铵标准溶液，按1.2.2方法显色，以空白为参比在400～700nm波长范围内进行扫描。结果表明，待测样品反应液在415nm有最大吸收峰，故选择415nm为检测波长。

2.1.2 显色剂用量的确定 脲酶水解尿素产生的氨，在适当条件下能与纳氏试剂中的碘化钾汞复盐作用生成棕色的碘化双汞铵。因此，在415nm波长下考察不同显色剂用量对吸光值的影响。由图1可见，随着显色剂用量的增加，吸光值呈直线上升趋势，当显色剂用量增加到1mL时，吸光值呈微弱下降的趋势。因此，选择显色剂1mL为最适用量。

图1 纳氏试剂用量对吸光值的影响Fig.1 Effect of nessler reagents amount on the color development

2.1.3 硫酸铵的标准曲线 在415nm波长、1mL显色剂用量下，以不同浓度的NH4+为横坐标，吸光值为纵坐标建立标准曲线。由图2可见，标准方程为y=0.2234x+ 0.0436，R2=0.9937，当NH4+的微摩尔数在0.75～4.5时呈良好的线性关系。

图2 硫酸铵标准曲线Fig.2 The standard curve of ammonium sulfate

2.2 豆浆脲酶活性检测条件的确定

2.2.1 尿素浓度的确定 脲酶能专一性地分解尿素产生氨，因此以尿素为底物，考察不同尿素浓度对脲酶酶活的影响，结果如图3所示。由图3可见，随着尿素浓度的增加，酶活呈增加趋势，当尿素浓度增加到3%时，酶活呈现平稳状态，这可能是由于底物已达到饱和。因此，选择3%的尿素作为最适底物浓度。2.2.2 反应温度的确定 反应温度对酶活的测定有显著影响，因此考察了不同反应温度对脲酶酶活的影响。由图4可见，随着反应温度的升高，脲酶酶活呈增加趋势，当反应温度达到35℃时，酶活逐渐下降。因此，选择35℃作为最适的反应温度。

图3 尿素浓度对脲酶酶活的影响Fig.3 Effect of urea amount on urease activity

图4 反应温度对脲酶酶活的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on urease activity

2.2.3 反应时间的确定 反应时间对酶活的影响如图5所示。由图5可见，随着反应时间的延长，脲酶酶活呈上升趋势，当反应时间达到9min时，酶活趋于平稳。因此，根据酶初速度的定义，选择7min作为最适的反应时间。

图5 反应时间对脲酶酶活的影响Fig.5 Effect of reaction times on urease activity

2.3 脲酶酶学性质的研究

图6 脲酶反应的最适pHFig.6 Optimal pH of urease

2.3.1 酶反应的最适pH 脲酶最适反应pH如图6所示。由图6可见，随着pH的上升，脲酶的活力逐渐增加，当pH达到7.0时，酶活力最大，随后又逐渐下降。因此，脲酶的最适pH在7.0左右。

2.3.2 酶反应温度稳定性 脲酶最适反应温度如图7所示。由图7可见，脲酶在25～40℃之间有较好的热稳定性，保存3h酶活保留率都在80%以上。当酶液在50℃时，酶活保留率仍在50%左右。

图7 脲酶的温度稳定性Fig.7 Thermal stability of urease

2.3.3 米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 在pH7.0，反应温度35℃的条件下，以尿素为底物，测定不同底物浓度下反应的初速度，按Lineweaver－Burk作图法取双倒数作1/v－1/[s]曲线（见图8），计算Vmax= 0.173mmol/min，米氏常数Km为0.0172mol/L。

图8 1/v－1[s]曲线Fig.8 1/v－1/[s]curve

3 结论

本文建立了大豆脲酶的定量测定方法，并对其酶学性质进行了初步研究。研究结果表明，纳氏试剂测定脲酶的最佳吸收波长为415nm，显色剂用量为1mL，当NH4+的微摩尔数在0.75～4.5μmol时呈良好的线性关系。脲酶酶活测定最佳反应条件为：尿素浓度3%，反应温度35℃，反应时间7min。脲酶活力随着pH的增加而增大，pH为7时，脲酶活力最高。脲酶反应的最适温度为35℃，脲酶在25～40℃之间有较好的热稳定性。利用Lineweaver－Burk双倒数作图法求得酶的Vmax=0.173mmol/min，Km为0.0172mol/L。通过对大豆脲酶活性的测定以及酶学性质的研究，为采用此酶快速测定尿素及重金属的残留奠定了理论基础。

[1]吴非，霍贵成.酶法钝化大豆胰蛋白酶抑制剂研究[J].粮食与油脂，2002（6）：9－10.

[2]Kunitz M.Cristallization of a trypsin inhibitor from soybean [J].Science，1985，101：668－691.

[3]Katsuro M， Motoo S.Purification characterization and application of an acid urease from Arthobacter mobilis[J].Journal of Biotechnology，1999，68：227-236.

[4]陈秀云，李湘鸣.豆浆中脲酶活性的测定[J].江苏预防医学，2002（3）：63-64.

[5]徐茂军，乐培恩，郑凯.氨气敏电极法定量测定大豆脲酶活性[J].食品科学，1993（9）：64-68.

[6]杨奇慧，舒璐，钟剑锋.不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究[J].饲料广角，2008，21：30-32.

[7]QB/T 2132-2008植物蛋白饮料豆奶（豆浆）和豆奶饮料[S].附录A脲酶的定性测定.

Establishment of determination method of urease in soybean juice and the enzymology characteristics

CAO Hui，XU Fei
（Medical Equipment and Food Institute，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China）

The determination of trypsin inhibitor in the laboratory was very difficult，but the activity of urease was positively correlated with trypsin inhibitor concentration.Therefore，we established the measuring method for urease activity，and then the enzymology characteristics were studied.Results showed that the optimal values for urease activity as follows：detection wavelength 415nm，amount of nessler reagents 1mL，urea concentration 3%，reaction temperature 35℃，reaction time 7min.Meanwhile，the optimum reaction pH and temperature of soybean urease was 7.0 and 35℃，respectively.Incubation at 25～40℃for 3h，the retention rate of enzyme activity was above 80%.The Kmand Vmaxof urease were 0.173mmol/min and 0.0172mol/L，respectively.

soybean milk；urease；nessler’s method；enzymology characteristics

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）01-0106-04

2010－09－06

曹慧（1976-），女，讲师，博士，研究方向：功能性配料及添加剂。

上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金（Slg08030）。