偏钒酸钠促进大豆芽异黄酮类物质黄豆苷元和染料木黄酮合成的研究

张 玲，丁淑玲，谷秀芳

（1.泰山医学院生物科学系，山东泰安271000；2.济南千佛山医院，山东济南250014；3.东莞东华医院，广东东莞523220）

偏钒酸钠促进大豆芽异黄酮类物质黄豆苷元和染料木黄酮合成的研究

张 玲1，丁淑玲2，谷秀芳3

（1.泰山医学院生物科学系，山东泰安271000；2.济南千佛山医院，山东济南250014；3.东莞东华医院，广东东莞523220）

目的：分析比较偏钒酸钠对大豆芽合成异黄酮类物质－黄豆苷元和染料木黄酮的影响；方法：将大豆种子在不同浓度的偏钒酸钠水溶液（0、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600mg/L NaVO3）于28℃萌发6d，第6d收获富钒大豆芽，洗净烘干至恒重，用95%乙醇提取大豆芽中的异黄酮类物质－黄豆苷元和染料木黄素，黄豆苷元和染料木黄素含量由高效液相色谱法测定；结果：分析测定结果表明，当大豆种子在浓度为200～600mg/L偏钒酸钠溶液中于28℃萌发6d，收获的大豆芽中的异黄酮类物质黄豆苷元和染料木黄酮的含量高于同等条件下其他浓度偏钒酸钠萌发液中萌发的大豆芽；结论：综合大豆芽的生长情况及大豆芽中异黄酮类物质－黄豆苷元和染料木黄酮含量等因素，在本实验条件下，萌发富钒大豆芽的适宜偏钒酸钠酸浓度为200～600mg/L，适宜的培育时间为96～120h，适宜温度为28℃。

偏钒酸钠，大豆芽，异黄酮，黄豆苷元，染料木黄酮

大豆异黄酮作为天然的植物雌激素在哺乳动物体内具有多种生物学功能，如大豆富含植物异黄酮、黄豆苷元、染料木黄酮及大豆黄素等，能够与哺乳动物体内各系统、器官组织细胞表面的雌激素受体结合，发挥效应[1]。大豆异黄酮的雌激素活性仅为天然雌激素的1/100～1/1000，在活体内起到雌激素和抗雌激素的双重调节作用，对女性有较好的保健作用，能够减轻或改善女性更年期症状，减少乳腺癌发病率[2]。现代药理学研究表明，大豆异黄酮可降低发生心血管系统疾病的风险[3]、阻止骨的重吸收[4]、抗氧化和降低血清胆固醇水平等[5]，染料木黄酮是酪氨酸蛋白激酶和DNA拓扑异构酶的潜在抑制剂，因此，大豆异黄酮的抗肿瘤作用突出地表现在一些对激素有依赖性的肿瘤上，如乳腺癌（雌激素依赖性肿瘤）等，大量的实验及临床研究已证明此点。大豆经发芽处理后其异黄酮含量显著增加，而抗营养因子含量显著减少[6]。因此，大豆芽是更符合现代营养保健理念的的天然食品。钒是人和动物的必需微量营养元素[7]。钒能够影响多种生物学反应，研究发现，卤素过氧化物酶中含有钒，钒还是生物固氮酶的活性中心[8]。但迄今为止，有关钒对植物异黄酮类物质合成影响的的研究还未见报道。本实验以不同浓度的偏钒酸钠水溶液培育大豆芽，通过高效液相色谱方法测定大豆异黄酮—黄豆苷元和染料木黄酮含量变化，重点考察钒对萌发中的大豆芽合成黄豆苷元和染料木黄酮的影响，以期为新型大豆功能食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆种 超市购买的当年收获的大豆；染料木黄酮（NIC－111704）、黄豆苷元（NIC－100347）标准品 购自中国国家标准品公司；色谱纯甲醇、乙腈 购自Fisher公司；实验用水 由超纯水机制备（18MΩ，美国Milli－Q公司）；0.45μm硝酸纤维素滤膜 购自Sigma公司；无水乙醇 购自上海化学试剂有限公司。

Waters 2695高效液相色谱仪 四元泵、在线脱气、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器；通风橱、恒温生物培养箱、药物粉碎机，KQ－600DB数控大型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；梅特勒1/100000电子天平 瑞士，梅特勒－托利多集团，ABS型；高速冷冻离心机 德国Beckman。

1.2 实验方法

1.2.1 富钒大豆芽的萌发 随机挑选子粒饱满的大豆用50℃热水浸泡30min，将水分沥干，然后用37℃自来水配制不同浓度的偏钒酸钠水溶液浸泡过夜，沥去浸泡液，将浸泡好的大豆移入抚育筐，每个浓度三份，于28℃生化培养箱中避光萌发，每天于9、13、18点分别喷洒对应浓度的偏钒酸钠水溶液三次，于第24、48、72、96、120h分别收获200g左右的鲜豆芽，记录豆芽鲜重，然后用自来水反复冲洗豆芽，再用蒸馏水反复冲洗，直到冲洗液中检测不到无机钒为止。然后用远红外电热恒温鼓风干燥箱65℃烘干至恒重（前后两次质量差小于2mg），最后称量干豆芽重量，并粉碎过100目筛。

1.2.2 异黄酮的提取条件 分别精密称取65℃烘干至恒重并粉碎过100目筛的大豆粉和大豆芽粉2g，每种平行称取三份，分别加入95%乙醇50mL，涡旋振荡30s，37℃超声提取20min，离心（12000r/min）20min，0.45μm硝酸纤维素滤膜过滤后储存于4℃，取10μL上样测定。

1.2.3 色谱条件 XTerra MS C183.5μm色谱柱（2.1× 150mm），流动相：乙腈∶0.1%冰乙酸（35∶65）梯度洗脱，流速：0.2mL/min，检测波长：254nm，柱温：25℃。1.2.4 对照品溶液的配制 精密称取65℃干燥至恒重的染料木黄酮：5.20mg，黄豆苷元：5.20mg，用适量色谱纯甲醇溶解后定容至10mL，作为对照品溶液。

1.2.5 检测限的测定 将上述配制的对照品溶液系列稀释，从最低浓度溶液开始上样测定，当信噪比大于3时所对应的最低浓度，即为该方法的检测限，本实验方法的检测限为3.15ng。 1.2.6 标准曲线的绘制 将对照品溶液系列稀释为：0.100000、0.050000、0.025000、0.012500、0.006250、0.003125mg/mL，上样10μL，测定各组分的峰面积，以对照品溶液浓度为横坐标，测得峰面积为纵坐标，进行线性回归，得各组分的回归方程、相关系数及线性范围见表1。

表1 标准曲线、相关系数及线性范围Table 1 Linearing of standard compounds

1.2.7 加标回收实验 精密称取已知含量的样品，分别加入一定量的对照标准品，依照供试样品异黄酮提取方法处理并测试，结果见表2。

表2 方法回收率Table 2 Recovery of the method

2 结果与分析

2.1 方法的准确性

加标回收实验的结果见表2，从表2可看出，本实验中有关大豆异黄酮类物质大豆苷元和染料木黄酮的提取方法及测定方法达到分析测试方法的要求，测定结果准确可靠。

2.2 生长时间对豆芽中黄豆苷元和染料木黄酮含量的影响

从表3可看出，大豆经适当的发芽处理后，随着培育时间的延长，黄豆苷元和染料木黄酮的含量迅速增加，从异黄酮含量的角度考虑，培育大豆芽的适宜时间应为96～120h。

表3 萌发时间对大豆芽黄豆苷元和染料木黄素含量的影响Table 3 The contents of daidzein，genistein in soybean sprouts harvested in different germinating period

2.3 偏钒酸钠对黄豆苷元和染料木黄酮合成的影响

从表4可看出，随着培养液中偏钒酸钠浓度的增大，富钒大豆芽中黄豆苷元和染料木黄酮含量随之增加，和同等条件下自来水中萌发的大豆芽相比，400mg/L NaVO3处理组的大豆芽异黄酮类物质黄豆苷元和染料木黄酮分别增加9.61%和73.34%，有关偏钒酸钠影响大豆芽合成异黄酮类物质黄豆苷元和染料木黄酮的机理还需要进一步探讨，但本研究结果提示，偏钒酸钠的参与或激活了黄豆苷元和染料木黄酮合成的有关酶类。

另外，本实验结果还提示，大豆芽对偏钒酸钠有很强的耐受力，有关大豆芽对钒的富集率和有机转化率及其富钒大豆芽的药理作用有待进一步的研究。

表4 不同浓度偏钒酸钠水溶液中萌发的大豆芽中黄豆苷元和染料木黄素含量Table 4 The contents of daidzein，genistein in soybean sprout which germinating in NaVO3solution with different concentrations

3 结论

偏钒酸钠能够在大豆萌芽过程中促进异黄酮类物质大豆苷元和染料木黄酮的合成，同时培育富钒大豆芽也为无机元素钒的生物有机化提供了新的途径，富钒大豆芽有望成为新一代的营养保健食品。结合大豆芽的生长情况及异黄酮含量综合考虑，培育富钒大豆芽的适宜偏钒酸钠浓度为200～600mg/L。

[1]Coward L，Barnes NC，Setchell KDR，et al.Genistein，daidzein，and their β－glycoside conjugates：antitumor is of lavones in soybeanfoodsfromAmericanandAsiandiets[J].JAgricFoodChem，1993，41：1961－1967.

[2]Martin PM，Horwitz KB，Ryan DS，et al.Phytoestrogen interaction with estrogen receptors inhuman breast cancer cells[J]. Endocrinology，1978，103：1860－1867

[3]Anthony MS，Clarkson TB，Hughes CL Jr，et al.Soybean is of lavones improve cardiovascular risk factors without affecting the reproductive system of peripubertal rhesus monkeys[J].J Nutr，1996，126：43－50.

[4]Jayo MJ，Anthony MS，Register TC，et al.Dietary soy isoflavones and bone loss in ovariectomized monkeys[J].J Bone Miner Res，1996，11：S228.

[5]Dodge JA，Glasebrook AL，Magee DE，et al.Environmental estrogens：effects on cholesterol lowering and bone in ovariectomized rat[J].J Steroid Biochem Mol Biol，1996，59：155－161.

[6]Phommalth S，Jeong YS，Kim YH et al.Effects of light treatment on isoflavone content of germinated soybean seeds[J].J Agric Food Chem，2008，56：10123－101238.

[7]Thompson KH.Orvig C：“Vanadium in diabetes：100 years from Phase 0 to Phase I”[J].J Inorg Biochem，2006，100：1925－1935.

[8]Guo JY，Han CC，Liu YM.A contemporary treatment approach to both diabetes and depression by cordyceps sinensis，rich in vanadium[J].Journal of Evidence－based Complementary and Alternative Medicine，2010，7：387－389.

Study on the synthesis of isoflavone including daidzein and genistein in soybean sprouts enhanced by sodium metavanadate

ZHANG Ling1，DING Shu-ling2，GU Xiu-fang3
（1.Department of Biological Science，Taishan Medical University，Taian 271000，China；2.Qianfoshan Hospital，Jinan 250012，China；3.Donghua Hospital，Dongguan 523220，China）

Objective：To analyse and compare the effect of sodium metavanadate on the synthesis of isoflavones including daidzein and genistein in soybean sprouts.Method：Soybean seeds were germinated in sodium metavanadate solutions （NaVO3）with different concentrations（0，200，400，600，800，1000，1200，1400，1600mg/L NaVO3）for 6 days at 28℃.The V-enriched soybean sprouts were harvested on the sixth day，the isoflavones including daidzein and genistein were extracted with 95%alcohol，and the contents of daidzein and genistein were determined with HPLC.Result：Soybean seeds germinated in 200～600mg/L NaVO3solutions for 6 days at 28℃showed ahigher content of isoflavones including daidzein and genistein than those obtained in NaVO3solutions with other concentration in the same germination donditions.Conclusion：The application of NaVO3solutions at a concentration of 200～600mg/L and germination for 6 days at 28℃ may be suggested for the production of the V-enriched chickpea sprouts，when comprehensively considering the contents of daidzein and genistein in soybean sprout together with its growth conditions.

sodium metavanadate；soybean sprouts；isoflavone；daidzein；genistein

TS201.2

A

1002－0306（2012）01－0079－03

2010－10－08

张玲（1966－），女，博士，副教授，研究方向：中草药与微量元素结合预防糖尿病。