杨梅素及其类似物抗氧化与乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

赵 丽，徐淑萍，李宗阳，张 蕾，张泽生，潘瑞乐，*

（1.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100193；2.天津科技大学，天津300457）

杨梅素及其类似物抗氧化与乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

赵 丽1，2，徐淑萍1，李宗阳1，张 蕾2，张泽生2，潘瑞乐1，*

（1.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100193；2.天津科技大学，天津300457）

目的：探讨杨梅素、杨梅苷及二氢杨梅素的抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性。方法：采用DPPH自由基清除和乙酰胆碱酯酶抑制高通量筛选模型进行研究。结果：杨梅素、杨梅苷和二氢杨梅素清除DPPH自由基的IC50值分别为18.34、28.89、10.70μg/mL，三种化合物的抗氧化活性均强于阳性药芦丁（IC50=31.32μg/mL），其中二氢杨梅素还强于VC（IC50=14.69μg/mL）；在质量浓度为0.25mg/mL时，杨梅素、杨梅苷和二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶的抑制率分别为：30.66%±4.05%、38.48%±1.98%、78.81%±2.23%，其中二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶抑制作用较显著，其IC50值为1546± 47.05μmol/L。结论：杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素均具有显著的DPPH自由基清除能力，本文首次报道二氢杨梅素具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，值得进一步深入研究。

杨梅素，杨梅苷，二氢杨梅素，DPPH自由基清除活性，乙酰胆碱酯酶抑制活性

阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease，AD）多发生于老年和老年前期，又称早老性痴呆症，是以进行性认知功能障碍为主要特征的神经退行性病变。随着人口老龄化，AD已经成为继心血管疾病和肿瘤之后严重威胁老年人生命健康的主要疾病之一[1]。目前，AD的发病机制尚不明确，其中胆碱能神经元丢失和自由基氧化损伤可能是其主要发病机制[2-3]。胆碱能损伤学说表明，AD患者脑内神经递质乙酰胆碱水平明显降低，临床多采用乙酰胆碱酯酶抑制剂，抑制乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，ACHE）降解乙酰胆碱，从而提高乙酰胆碱水平的方法治疗AD[4-5]。美国FDA批准的5种临床治疗AD的药物中4种为乙酰胆碱酯酶抑制剂[6]，表明抑制乙酰胆碱酯酶活性仍不失为一种有效的AD治疗途径。自由基假说表明，AD患者的脑内还出现氧含量偏高，氧化应激损伤较显著的现象[7]，可通过使用抗氧化剂辅助治疗，改善患者脑内自由基消除系统的缺陷。已有体外实验显示，维生素E可保护培养的神经元抵抗β-淀粉样蛋白的侵害作用，能延缓AD的进程，同时建议将抗氧化剂与胆碱酯酶抑制剂合用，通过清除自由基以及抑制乙酰胆碱酯酶的活性来达到协同治疗AD的目的[8]。杨梅素、杨梅苷及二氢杨梅素具有较强抗氧化活性[9-11]，但大多只是采用紫外分光光度法进行活性比较。本文采用了DPPH自由基清除微量模型进行高通量筛选，根据IC50值和TEAC（Trolox Equivalent Antioxidant Capacity，Trolox当量）精确定量其抗氧化能力。并在此基础上，初步探讨了杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素的乙酰胆碱酯酶抑制活性，旨在筛选出抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制活性均较好的物质，为研发治疗AD的新药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品 杨梅素、二氢杨梅素为本课题组从植物藤茶中分离得到，杨梅苷为从杨梅树皮中分离得到，经UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR光谱分析鉴定结构，HPLC纯度检测在95%以上（面积归一化法）；乙酰胆碱酯酶 来源于C57BL/6J品系正常雄性鼠，购自北京军事医学科学院动物中心；碘化硫代乙酰胆碱、他克林、DTNB（5，5’-二硫双硝基苯甲酸）、十二烷基硫酸钠、DPPH、trolox 均购自Sigma公司；PBS磷酸缓冲盐溶液 购自索莱宝生物科技公司；芦丁、维生素C、氢溴酸加兰他敏、盐酸多奈哌齐 购自中国药物生物制品检定所；其它化学试剂 均为分析纯，购自北京化工厂。

1.2 实验方法

1.2.1 DPPH自由基清除微量模型的筛选方法

1.2.1.1 trolox标准曲线的绘制 以trolox（6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，一种合成的类似于VE的水溶性物质）作为自由基反应的参比物，考察筛选模型的稳定性和重复性。

精密称取trolox粉末2.8mg，2mL甲醇溶解，配制成1400μg/mL的样品溶液，倍比稀释成70、56、40、32、25、12.5、6.25μg/mL的系列浓度，分别吸取50μL加入96孔板中，加入250μmol/L的DPPH甲醇溶液150μL，对照组用50μL甲醇代替样品溶液，空白组用150μL甲醇代替DPPH溶液，充分振荡混匀，37℃孵育30min，515nm处测其吸光值，按下列公式计算自由基清除率，求得IC50值。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A样本-A空白）/A对照]×100% 1.2.1.2 DPPH自由基清除微量模型的筛选 芦丁、VC作为对照品，trolox作为自由基反应的参比物，DPPH自由基清除率测定和IC50值计算方法同1.2.1.1。

1.2.2 乙酰胆碱酯酶活性的高通量筛选方法 采用改良的Ellman方法[12]建立乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选体系，以阳性药他克林作为参照验证体系的合理性。

以小鼠全脑10%匀浆作为乙酰胆碱酯酶酶液，反应体系中加入32μL酶液、160μL系列浓度的他克林或样品溶液（对照组抑制剂为1.25%DMSO）和400μL显色剂DTNB（空白组在加DTNB后加入400μL SDS终止反应），补水至1.2mL，37℃孵育5min，加入底物ATCH（碘化硫代乙酰胆碱）37℃孵育15min，加入400μL SDS终止反应，用酶标仪在412nm处测定吸光度值。根据以下公式计算乙酰胆碱酯酶抑制率，并求其IC50值。根据阳性药的IC50值判断筛选体系是否合理。

乙酰胆碱酯酶抑制率（%）=[1-（A样本-A空白）/（A对照-A空白）]×100%

2 结果与分析

2.1 trolox标准曲线的绘制

每个浓度3个复孔，实验重复3次，绘制当量标准曲线，三次实验标准曲线见图1，trolox的IC50平均值为37.55μg/mL，RSD为2.37%，说明该方法稳定可靠，重复性好。

图1 三次实验trolox标准曲线Fig.1 The standard curve of trolox

2.2 杨梅素及其类似物DPPH自由基清除能力实验结果

表1 样品与trolox、阳性药抗氧化能力对照表Table 1 The antioxidant activities of sample and positive drugs

图2 DPPH自由基清除微量模型筛选结果Fig.2 DPPH free radical-scavenging assay

杨梅素、杨梅苷及二氢杨梅素的DPPH自由基清除能力的IC50分别为：18.34、28.89、10.70μg/mL，明显强于芦丁（IC50=31.32μg/mL），其中二氢杨梅素还强于VC（IC50=14.69μg/mL）。以trolox为参比物，计算了阳性药及供试药的TEAC值（即每克抗氧化物质的自由基清除能力相当于Trolox的自由基清除能力的微摩尔数），见表1。DPPH清除率与样品浓度的相关性见图2。

2.3 杨梅素及其类似物乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选结果

2.3.1 阳性药的验证结果 以他克林不同倍比稀释浓度与乙酰胆碱酯酶抑制率作相关性曲线，得出他克林的IC50=1158±25.09nmol/L（见表2）。与文献[13]报道他克林的IC50值=1.15×10-6mol/L基本一致，说明该筛选体系稳定可靠。

表2 阳性药他克林的乙酰胆碱酯酶抑制作用（n=3）Table2 Theacetylcholinesteraseinhibitoractivityoftacrine（n=3）

2.3.2 杨梅素及其类似物的乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选 在0.25mg/mL浓度下，杨梅素、杨梅苷及二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶的抑制率分别为：30.658%± 4.048%、38.477%±1.984%、78.81%±2.23%，其中二氢杨梅素的乙酰胆碱酯酶抑制效果较为显著（见图3）。鉴于二氢杨梅素对乙酰胆碱酯酶有较好的抑制效果，进一步对二氢杨梅素溶液倍比稀释成不同浓度进行筛选，求得其IC50值为1546±47.05μmol/L（见表3）。

图3 乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选结果Fig.3 Acetylcholinesterase inhibitor activity assay

表3 二氢杨梅素的乙酰胆碱酯酶抑制作用（n=3）Table 3 The acetylcholinesterase inhibitory activity of dihydromyricetin（n=3）

3 讨论

杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素均属于多羟基黄酮类化合物，杨梅苷（3'，4'，5'，5，7-五羟基黄酮-3-O-α-L-鼠李糖苷）是由杨梅素（3，5，7，3'，4'，5'-六羟基黄酮）的3号位上连接一个鼠李糖苷而形成的黄酮苷类化合物，而二氢杨梅素（3，5，7，3'，4'，5'-六羟基-2，3双氢黄酮醇）是由杨梅素的2、3位上加氢而形成的双氢黄酮醇类化合物，三者3'，4'，5'具有的酚羟基是亲核取代反应易发生部位[14]，已有较多文献证实三者均具有显著的抗氧化活性。

DPPH自由基的清除能力可反映药物的抗氧化活性，传统大多采用分光光度法测定，一次只能测一组数据，操作繁琐，准确性差。本文采用DPPH自由基清除微量模型，以trolox作为自由基反应的参比物，用酶标仪一次测定多组样品数据，样本用量小，测定快速准确，尤其适用微量天然产物抗氧化活性的筛选[15]。

杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素活性已有很多研究[16-18]，但乙酰胆碱酯酶抑制活性目前未见报道。本研究采用乙酰胆碱酯酶抑制活性高通量筛选模型对杨梅素、杨梅苷、二氢杨梅素进行了研究。结果表明，杨梅素、杨梅苷对乙酰胆碱酯酶抑制抑制活性较弱，二氢杨梅素抑制活性较显著，其IC50值为1546±47.05μmol/L。二氢杨梅素由于引入氢原子后，分子结构的柔性增加，分子作用力减弱，水溶性比杨梅素增加，可能是其活性较好的原因之一。

目前批准上市的临床常用AchE抑制剂主要有他克林（tacrine）、多奈哌齐（donepezil）、卡巴拉汀（rivastigmine）、加兰他敏（galantamine）和石杉碱甲（huperzine A）等，但都伴随着不同程度的不良反应，主要副作用是胃肠道反应，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻、厌食等，其它少见的副作用是失眠和抑郁加重，他克林尚有肝毒性，在中国市场已停用[19]，因此寻找疗效显著、无副作用的治疗AD的天然活性成分具有重要的现实意义。本研究结果显示，二氢杨梅素同时具有较强乙酰胆碱酯酶抑制及抗氧化活性，可以作为治疗AD的天然产物或先导化合物进行深入的研究。

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Study on the antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of myricitrin and its structure-similar compounds

ZHAO Li1，2，XU Shu-ping1，LI Zong-yang1，ZHANG Lei2，ZHANG Ze-sheng2，PAN Rui-le1，*
（1.InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Objective：To investigate the antioxidant and acetylcholinesterase inhibitory activities of myricetin，myricitrin and dihydromyricetin in vitro.Methods：A high-throughput screening assay for 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）free radical-scavenging and acetylcholinesterase inhibitory activity were used.Results：The antioxidant activities of three compounds were excellent and better than the postive drug Rutin（IC50= 31.32μg/mL）.The IC50values of three compounds were 18.34，28.89，10.70μg/mL respectively，among them the free radical-scavenging activity of dihydromyricetin even better than the other positive drug Vitamin C（IC50= 14.69μg/mL）.Under the concentration of 0.25mg/mL，the acetylcholinesterase inhibition rates of myricetin，myricitrin，dihydromyricetin were 30.66%±4.05%，38.48%±1.98%，78.81%±2.23%respectively，in which the acetylcholinesterase inhibitory activity of dihydromyricetin was the most significant and the IC50value was 1546±47.05μmol/L.Conclusion：The DPPH free radical-scavenging activities of myricetin，myricitrin，and dihydromyricetin were all significant.Furthermore，the acetylcholinesterase inhibitory activity of dihydro-myricetin was the first reported，it was worth for further study.

myricetin；myricitrin；dihydromyricetin；DPPH free radical-scavenging activity；acetylcholinesterase inhibitory activity

TS255.1

A

1002-0306（2012）01-0056-04

2011－01－10 *通讯联系人

赵丽（1985-），女，硕士研究生，研究方向：食品分析。

创新药物研究开发技术平台建设（2009ZX09301-003）；国家支撑计划（2007BAI27B05）。